完整word版BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤corrZYH0520.docx
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完整word版BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤corrZYH0520
BDFACSCalibur流式细胞仪
简易操作步骤
一、开机
1）先打开净化交流稳压电源，其次打开110V稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。
2）
3）
向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN位置。
4）
二、开启CellQuest软件、编辑实验文件
1）在屏幕下方点击CELLQuest（第四个图标）启动软件。
桌面会出现一’Untitled’实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。
2）从工具板中点击散点图图示。
在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。
出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。
3）在出现的散点图对话方框中点击PlotSource，选择AcquisitionandAnalysis（收取、分析），确认X和Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024。
4）从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：
FL1-H1024；如果是双标，Y轴选择：
FL2-H1024（根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明），如果是单标，Y轴选择：
SSC-H。
点击OK，FL1/FL2的散点图出现。
完成后可将重制图移至原图右方。
说明：
散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。
在图中，横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC-H1024；双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H1024、FL2-H1024，X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。
仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。
修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：
细胞大小，SSC：
细胞折射率，FL1：
FITC绿色荧光，FL2：
PE橙色荧光，FL3：
PerCP红色荧光）。
5）在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。
6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。
单色荧光只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择FL-1，纵坐标默认为Counts；若是双色荧光，需画2个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024，另一个横坐标选择FL-2-1024；
7）在上面直方图中画出M1和M2，其中M1代表隐性数目（一般标示是101），M2代表阳性数目（除M1以外所有的部分）。
8）从Stats菜单中选择QuadrantStats（象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。
三、建立仪器和计算机之间通讯
从Acquire菜单中选择ConnecttoCytometer（快捷键Win+b），此时会出现AcquisitionControl对话方框。
四、仪器设置文件
注意：
实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。
仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。
仪器设定文件（Instrumentsettings），含信号器高压（Detector/Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。
一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps--Threshold--Compensation。
1）检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。
出现Detectors/Amps窗口。
在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC（根据实验样品确定，一般细胞选择LIN，细菌选择LOG），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。
2）从Cytometer菜单中选择Threshold，出现Threshold窗口在Threshold窗口：
确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。
将其拖至空白区。
3）从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。
将其拖至空白区。
五、上样品、设置仪器
使仪器处于HighRUN，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。
确认AcquisitionControl窗口中Setup前需打叉或打勾（即不储存数据，用于仪器设置），点击Acquire。
1、调节FSC/SSC探测器（电压）
观察FSC/SSC图的变化。
FSC电压（Voltage）预设为E00，可调节AmpGain从1.00—9.99使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。
调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。
调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。
调整定位后，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
2、Gating圈选
细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。
我们常用前方散射（FSC）与侧方散射（SSC）的二维位图，即散射光图谱（ScatterPlot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。
1）在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1区域（如下图）。
分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。
如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates→Regionlist，以鼠标点选R1，再按Delete键删除R1区域。
删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。
2）选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Formatdotplot。
在出现的对话方框内，将NoGate改选G1=R1。
点击OK。
3）
3、调节FL1、FL2的探测器（电压）
1）点击AcquisitionControl窗口中的Restart。
在Detector/Amps窗口中调节FL1、FL2的电压，使NegativeControl细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。
2）在Threshold窗口，适当地提高FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。
唯需注意不要切掉主要细胞族群。
3）点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。
移去阴性对照管，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光，不要再改动Detector/Amps、Threshold等数值。
4、调节荧光补偿
说明：
最适化的最后一步是调节光谱重迭。
（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。
1）HighRUN，换上单染CD3-FITC管。
点击AcquisitionControl窗口中的Acquire。
调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。
补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。
调节完毕，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
2）移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。
点击AcquisitionControl窗口中的Restart。
调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。
调节完毕，点击AcquisitionControl窗口中的Pause。
3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击AcquisitionControl窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。
当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。
4）移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。
关闭Compensation窗口。
您已完成2色荧光之最适化。
六、收集实验数据
1）决定储存细胞总数：
预设之「储存细胞总数」为10000。
如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition&Storage，并在出现的窗口功，确认「CollectionCriteria」从10000ofAll，再点击OK。
2）
找个档案匣准备储存数据，本机所有数据都贮存在D盘data盘中，按实验日期编排。
从Acquire菜单中选择ParameterDescription，出现ParameterDescription对话方框。
点击Folder，并在随后出现之对话方框，选择「YourFolder」或新建活页夹，点击此对话方框的Select’YourFolder’（一般用实验日期来命名Folder）。
3）命名即将储存之文件名：
点击ParameterDescription对话方框的File，出现文件名编辑窗口，输入文件名（根据实验来决定），点击此对话方框的OK。
4）Optional：
如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。
如P1：
Size,P2：
Granularity,P3：
CD3FITC。
输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。
5）计数器Counters：
从Acquire菜单中选择Counters.窗口会显示样品分析速率、与总数进度
6）开始收集实验数据。
LOWRUN（根据Counters来调节速度，一般保持在700-800/Second），将第一管样品放到检测区，在AcquisitionControl窗口中，将Setup改成Setup，此时CellQuest会自动显示YourFolder文件名为资料文件名。
点击“Acquire”便可启动样品之分析测定与数据储存。
当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件文件名.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成文件名.002。
等待下一指示。
7）换上超纯水，清洗管路，直到Counters持续显示0/Second30s（约为10-20s），换上下一管样品，点击“Acquire”启动样品之分析测定与数据储存。
可继续分析直到所有检品都分析完毕。
七、退出软件并关机
1）.检品分析完毕后，记得从屏幕上方File指令栏选择SaveAs，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。
2）检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方Acquire指令栏中，选取DisconnecttoCytometer以断绝计算机与仪器间之联机。
之后如不分析数据，您可退出软件“File”“Quit”（遇有选项永远选择“Don‘tsave”），进行关机程序。
3）以2ml10％漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1ml，再将样品架置于中位HIRUN十分钟。
改用2mlDIwater。
重复上述程序，样品架上留约1mlDIwater。
按STANDBY五分钟。
4）先关闭计算机，其次关闭流式细胞仪，再次关闭110V稳压输出电源，先打开净化交流稳压电源。
5）向前拉开储液箱抽屉，先将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向），再取出废液桶，将废液倒进预先装有84的烧杯中，灭菌处理，装好废液桶，将减压阀方向调在RUN位置。
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