伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征.docx

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伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征

伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征

袁德保杨晓泉黄科礼

【摘要】　　研究了色谱方式对伴大豆球蛋白组成3个亚基的分离纯化工艺条件，并利用圆二色光谱对纯化取得的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。

结果显示：

利用离子互换色谱（DEAEsepharosefastflow，DEAE为二乙氨乙基）和金属螯合层析（Immobilizedmetalaffinitycolumn，IMAC）相结合的方式，能将3个亚基组分完全分开，取得了能制备相对大量的3个亚基α′,α和β的稳固工艺，纯度为95%，回收率达75%。

远紫外CD结果显示，在3个亚基的二级结构中，α螺旋较少，但都具有较高含量的β折叠和无规卷曲；近紫外CD结果显示，3个亚基在制备进程中因为尿素的变性作用，都已经散失了三级结构。

【关键词】伴大豆球蛋白；亚基；纯化；结构

　　AbstractTheisolationprocessofthethreeconstituentsubunitsofsoybeanconglycininwasstudiedbythechromatographicmethodandthenthesecondaryandtertiarystructuresofthreeconstituentsubunitswerecharacterized.Theresultsshowedthatthecombinationofdiethylaminoethyl（DEAE）SepharoseFastFlowcolumnandimmobilizedmetalaffinitycolumn（IMAC）succeededinisolatingthesesubunitscompletely,givinghighpurity（95%）andatotalrecoveryratioof75%.ThedatafromfarUVCDshowedthesubunitshadrelativelylowcontentofαhelixandhighcontentofβsheet,βturnandunorderedstructure.Thecontentsoftheirβsheetintheisolatedsubunitswerehigherthanthoseofconglycinin,whereastheircontentsofunorderedstructureswerelowerthanconglycinin.ThenearUVCDshowedtheisolatedsubunitslosttheirtertiarystructureduetothedenaturalizationofureainthepurificationprocess.

　　KeywordsConglycinin;Subunits;Purification;Structure

　　1引言

伴大豆球蛋白是大豆的两种要紧贮藏蛋白之一，占大豆贮藏蛋白含量的30%[1,2]。

伴大豆球蛋白通常以由3个亚基α′,α和β通过非共价键形成的三聚体形式存在。

大豆贮藏蛋白因其良好的营养及功能特性，使其在食物领域中普遍应用。

目前，伴大豆球蛋白的亚基水平的研究是一个热点，因为这种研究能说明伴大豆球蛋白在保健功效和食物应用方面的机制[3～6]。

Maruyama等［７］利用基因工程的方式，取得了未进行后期糖基化修饰的亚基和不具有扩展区的亚基（αc和α′c）。

Lovati等[3]利用制备型双向电泳取得了单一的β亚基和α′,α的混合物。

Maruyama等[8,9]从大豆缺失体中分离取得了3种亚基组分。

Duranti等[10]成立了从传统大豆品种中较大规模制备α′的方式。

另外，从传统大豆品种中制备3个亚基的方式也有报导[11,12]。

但仍需成立一种能制备高纯度且较大制备量的分离制备方式[13,14]。

而上述提到的几种制备方式在一样实验室难以操作（如制备型双向电泳、大豆缺失体品种），且制备量小。

本研究成立了能普遍适用的制备（具有必然制备量）高纯度伴大豆球蛋白的制备方式，并对制得的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。

　　2实验部份

　　仪器与试剂

UVP凝胶成像系统；AKTA蛋白质纯化仪（美国GE公司）；PYCZ30垂直板电泳仪（北京六一仪器厂）；MOS450园二色谱仪（法国BioLogic公司）。

低变性脱脂大豆片（白豆片，山东新嘉华提供）。

白豆片粉碎后，过０．１８mm孔径筛并贮存于4℃下密闭容器中。

豆粉蛋白质含量为（±）％，氮溶指数％。

树脂（DEAEsepharosefastflow和Immobilizedmetalaffinitycolumn）和柱子（cm×30cm,美国GE公司）。

试剂为分析纯或更高级别。

　　实验方式

　　伴大豆球蛋白的制备

　　采纳Nagano法[15]制备伴大豆球蛋白，电泳鉴定纯度后，透析、冻干后4℃保留以备用。

　　亚基组分的分离纯化

　　5g伴大豆球蛋白溶解在60mL含6mol/L尿素的TrisHCl缓冲液（简称为标准缓冲液,pH）中，先用标准缓冲液将离子互换柱平稳。

上样后,穿透部份洗下2个穿透峰，然后进行线性梯度洗脱（0～mol/LNaCl），其中第二个峰为纯度很高的α′和α的混合物。

将第二个洗脱峰透析、冻干，以便进行进一步的IMAC分离。

将α′和α的混合物（5g）溶于60mLmol/LTrisHCl缓冲液（pH,含mol/LNaCl和6mol/L尿素）。

先将吸附了Ni2+的IMAC柱子用mol/LTrisHCl缓冲液（pH,含mol/LNaCl和6mol/L尿素）平稳好，然后上样。

用上述缓冲液将柱子上未被吸附的部份洗脱下来，用含有mol/L咪唑的上述缓冲液能够将α′洗脱下来。

将各部份洗脱液搜集，透析、冻干以备用。

　　十二烷基磺酸钠

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）SDSPAGE电泳依照Laemmli法[16]进行。

　　２．２．４远紫外和近紫外圆二色谱分析

　　采纳园二色谱仪器进行CD测定。

远紫外圆二色光谱测定样品浓度为g/L,近紫外圆二色谱测定样品浓度为1g/L。

样品溶解在5mmol/LTrisHCl缓冲液中。

扫描次数为2次。

二级结构计算软件为CDPro。

　　3结果与讨论

　　伴大豆球蛋白制备

通过Nagano方式[15]制备取得了伴大豆球蛋白。

如图1所示，伴大豆球蛋白（图1，泳道2）具有其典型的３条电泳条带，别离对应的是3个亚基α′,α和β（分子量别离为75,71和51kDa）。

通过光密度扫描技术，计算取得3个亚基条带的光密度之和占总个泳道的光密度比值的95%，即制备取得的伴大豆球蛋白的纯度约为95%。

　　伴大豆球蛋白组成亚基的色谱分离和制备

利用离子互换色谱对制备取得的伴大豆球蛋白，进行了第一时期的纯化。

纯化后取得两个穿透峰（峰1和峰2），然后进行线性洗脱（0～mol/LNaCl），洗脱取得峰3、峰4和峰5。

各个洗脱峰的电泳图谱见图1。

从图1可见，峰1要紧组分是一些未被吸附的杂质，峰2的要紧组分是β亚基，峰3的左半部是β亚基，而右半部是未完全分开的含有一些杂带（介于α′,α和β之间）的组分。

峰4是纯度很高的α′和α的混合物。

峰5是部份受大豆球蛋白中的碱性亚基污染的α′和α的混合物。

将纯度很高的α′和α的混合物（峰4）搜集，透析冻干，以便用金属螯合层析进行下一步的分离纯化。

而将峰2和峰3的左半部搜集，透析、冻干，作为纯化的β亚基以备用。

5g伴大豆球蛋白通过离子互换色谱可制备得约gβ亚基、g高纯度的α′和α的混合物，回收率接近82%。

纯化的第二部份是用金属螯合层析进行α′和α混合物的进一步分离以取得纯的α′和α的单亚基。

载有Ni2+的金属螯合柱对其中部份蛋白有吸附作用，而对另外一部份蛋白无吸附作用。

峰1为穿透峰，通过利用含有mol/L咪唑的缓冲液洗脱下来的峰为峰2。

通过电泳分析，峰1为大体没有吸附作用的α，而峰2为吸附作用强的α′。

将对应峰进行搜集，透析，然后冻干，以备用。

5gα′和α的混合物通过IMAC色谱分离，别离制得约和g，回收率约92%。

总回收率为两部份回收率之积，约75%。

将冻干的样品进行了SDSPAGE分析（见图2）。

其中泳道1为标准分子量，泳道2为起始原料伴大豆球蛋白，泳道3为β，泳道4和5别离是α′和α。

通过光密度扫描，各个亚基的纯度都接近95%。

　　制备取得的亚基的远紫外CD

利用远紫外圆二色光谱对纯化取得的样品的二级结构进行了表征（图3）。

从图3可见，各个亚基组分呈现典型的远紫外CD曲线形状，利用软件CDPro对取得的图谱进行分析，取得了各个样品二级结构的数据（表1）。

从表1可见，包括伴大豆球蛋白在内的各个样品的二级结构中，α螺旋含量比较少，均少于10%，尤其以伴大豆球蛋白的含量最少（%）。

相较伴大豆球蛋白，各个亚基的β折叠结构都略微减少。

而β转角的含量相差不大。

可能是因为受纯化进程中变性剂尿素的作用，各个亚基的无规卷曲结构均比伴大豆球蛋白的含量高。

表1伴大豆球蛋白及纯化取得亚基的二级结构的计算结果（略）

　　制备取得的亚基的近紫外CD

利用近紫外CD对伴大豆球蛋白和纯化取得的α′，α和β的三级结构进行了表征（图4）。

从图4可见，伴大豆球蛋白在270nm处有一个很明显的三级结构特点峰，说明利用Nagano方法提取取得的伴大豆球蛋白具有天然的高级结构。

而纯化取得的α′、α和β都已经不具有明显的三级结构应具有的特点峰。

表示在分离纯化进程中，各个组分在尿素等变性剂的作用下，已经完全散失了三级结构。

　　4结论

本研究以伴大豆球蛋白为原料，利用离子互换色谱和金属螯合层析对其组成亚基的分离、纯化和对取得的亚基的结构性质的表征，结论如下：

（１）利用本方式能够制备较大量的伴大豆球蛋白，纯化取得的亚基组分纯度能达到95%，回收率能达到75%；（２）远紫外CD显示，伴大豆球蛋白及其亚基，α螺旋含量都较少，而β折叠、β转角、无规卷曲含量较高。

相较伴大豆球蛋白，各亚基的β转角含量相近，β折叠含量稍少，而无规卷曲含量稍高；（3）近紫外CD显示，用Nagano法提取取得的伴大豆球蛋白具有明显天然的三级结构，而纯化取得的各个亚基在纯化进程都已造成其三级结构的散失。

【参考文献】

　　1KinsellaJE.Advancesinfoodandnutritionresearch.SanDiego:

AcademicPress,1992:

89～208

　　2DamodaranS,AlainParaf.Foodproteinsandtheirapplications.NewYork:

CRCPress.1997:

257～291

　　3LovatiMR,ManzoniC,GianazzaE,SirtoriCR.J.Agric.FoodChem.,1998,46（7）:

2474～2480

　　4ManzoniC,LovatiMR,GianazzaE,SirtoriCR,MoritaY.J.Agric.FoodChem.,1998,46（7）:

2481～2484

　　5Manzo