基因工程综合性教学实验.docx

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基因工程综合性教学实验

大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因

克隆表达纯化

吴海珍王善利

赵健俞建瑛张惠展

华东理工大学

应用生物学系

二○○五年一月

第一部分

碱性磷酸单酯酶基因的

定位、克隆与表达

实验流程图

碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位――SouthernBlotting

碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增――PCR扩增

PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体――连接

连接产物转化大肠杆菌受体菌――转化

转化子质粒DNA的抽提――快速法制备质粒

转化子的鉴定――限制性内切酶酶切

目的转化子DNA的大量制备――碱法抽提质粒DNA

酶切回收克隆的目的基因片段――回收目的基因

重组表达型质粒的构建――连接、转化、鉴定

重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳

实验路线

1DNA的酶切

摘要本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。

1.1实验原理

DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相对应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。

这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。

限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。

早在20世纪50年代初微生物体内的限制核修饰作用就已发现，10年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。

以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修饰系统，两种不同来源的－噬菌体（K和B）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。

当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。

这一现象普遍存在与原核细菌中。

但由于宿主细胞内的降解作用的不完全，入侵的DNA分子总有极少数能完整保留下来并得以在细胞体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。

这修饰过的DNA分子再重新制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制――修饰作用被解除。

1.1.1限制性核酸内切酶的分类

目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类（见表1-1）。

其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA的重组实验。

I类和III类酶严格地说应该称为限制――修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位，包含在同一酶分子中。

表1-1各类限制性内切酶的特性

I类酶

II类酶

III类酶

酶分子

三亚基双功能酶

内切酶和甲基化酶分开

二亚基双功能酶

识别位点

二分非对称序列

4～6bp短序列，

大多数为回文结构

5～7bp非对称序列

切割位点

距离识别位点至少

1000bp，无特异性

在识别位点中

或靠近识别位点

在识别位点下游24～26bp处

限制性反应与甲基化反应

互斥

分开的反应

同时竞争

限制作用所需的辅因子

ATP、Mg2+、

S-腺苷甲硫氨酸

Mg2+

ATP、Mg2+、S-腺苷

甲硫氨酸（非必需）

DNA重组中的用途

无

有

无

1.1.2II类限制性核酸内切酶的基本特性

II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。

该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组实验中广泛使用。

目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的酶NEB（NewEnglandBiolabs）公司品种最多，达220余种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。

这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成（见图1-1）

图1-1限制性内切酶的命名原则与示例

1.1.2.1识别位点

II类限制性内切酶的识别位点具有180°旋转对称的回文结构，常用的识别序列往往为6个碱基对，例如HindIII的识别序列：

其中一部分的识别序列某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率，例如AvaI的识别序列就是典型的结构：

有的酶识别位点为4或5碱基对，如AluI、HaeIII和Sau3AI（见图1-2）等，在DNA上的出现频率则较高，而象Sau3AI切割DNA后产生的是粘性末端，且与BamHI切割后的粘性末端相同，为大规模克隆提供了可能。

实际应用中利用Sau3AI高频现象，结合DNA的部分酶切策略进行研究也是常用的实验手段。

图1-2限制性内切酶的命名原则与示例

另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在DNA链上出现频率也相对较低，如FseI（5’-GGCCGGCC-3’），出现频率为1/48=1/65kb。

实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。

大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT的识别序列（如DraI：

5’-TTTAAA-3’；PshBI：

5’-ATTATT-3’；SspI：

5’-AATTAA-3’）较为频繁的出现，而链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基对的识别序列（NaeI：

5’-GCCGGC-3’；SmaI：

5’-CCCGGG-3’；SacII：

5’-CCGCGG-3’）较常见。

1.1.2.2粘性末端

限制性内切酶切割DNA产生的末端根据被切开的DNA末端性质的不同（不考虑碱基序列）可分两大类：

平端和粘端，而后者又可分为3’-OH突出或5’-P突出两种，分布情况见图1-3，故DNA分子的连接通常发生在同种限制性内切酶酶切后的DNA间。

图1-3DNA酶切产生的三种末端

实际上DNA重组应用中，由于不同限内酶酶切能产生相同粘性末端，因此DNA分子的连接可发生在不同限内酶之间，常见的DNA分子连接情况见图1-4。

而在重组工作中如没有合适的酶切口产生相同的粘性末端，则可对酶切后的突出粘性末端进行补平，采用平头连接策略。

图1-4DNA粘性末端的连接效果

1.1.2.3甲基化影响

大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。

部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：

（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；

（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

1.1.2.4近末端切割

基因工程的操作中经常要对DNA片段进行精细切割，在PCR产物中有些甚至只切割一个碱基对。

不同的内切酶对裸露的酶切位点不能切断，因此必需在酶切位点外侧加上一个或几个保护碱基，表1-2中列举了常用的十五种内切酶在不同保护碱基下的切割效果，一般保护碱基大于三个碱基对时能完全切割。

但是在有些PCR产物中即使保护碱基大于五时也不一定能被有效切断，这可能是PCR产物纯化中残留的杂质影响酶切或是PCR产物末端聚合不完整。

表1-2DNA末端酶切位点的切断情况

Enzyme

末端碱基数

BamHI

BglII

ClaI

EcoRI

EcoRV

HindIII

KpnI

NcoI

PstI

SacI

SalI

SmaI

SphI

XbaI

XhoI

-：

不能切断；±不能完全切断；+：

完全切断

1.1.3限制性核酸内切酶的使用

限制性核酸内切酶在基因工程属常用工具酶，主要用于基因物理图谱的绘制、基因片段的鉴定或获得、用于杂交的DNA探针的制备等，而酶切的条件控制则是非常重要的。

1.1.3.1作用条件

在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：

（1）反应温度常规酶切反应均在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶确定反应温度。

当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切（见1.1.3.3）。

（2）缓冲体系厂商提供的限制性核酸内切酶有其相对应的缓冲液，一般的缓冲液种类为4-10种左右，按盐离子浓度可分为三大类：

高盐、中盐和低盐。

缓冲液配制为10×的母液，酶切时稀释10倍。

常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表（宝生物工程公司）选择缓冲液或采用万能缓冲液（Promega）。

（3）反应时间常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长2～3小时，有时甚至可以过夜。

一般来说，在DNA量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA时，可以考虑酶切过夜。

另对特殊实验，如对基因组DNA进行部分酶切，则在酶量投入一定的前提下，减少反应时间降低对DNA切割的程度。

（4）加入酶量在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。

但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的储存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。

因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：

不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。

（5）DNA纯度在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。

另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，一般DNA的质量浓度在1g/l体系中能取得好的酶切效果。

当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大（如从15l-->30l），将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果

1.1.3.2酶切方式

酶切方式可分为部分酶切与完全酶切：

（1）部分酶切指的是同一DNA片段上的位点有些被切开而另一些未被切开，此法主要用于基因的克隆。

在某些基因内部可能有此酶的切点，用完全酶切进行克隆时难以得到完整基因。

部分酶切实施方法：

a）在不同的时间从同一个酶反应管中取样终止反应，利用时间控制酶切程度，该方法比较繁琐，不易掌握得恰到好处；b）固定酶切的反应温度和反应时间，控制酶的投入量，一般是在反应管中加入不等量稀释的酶，利用不同酶浓度控制酶切程度，该方法因易控制而被广泛应用。

（2）完全酶切适用于除目的基因克隆以外的绝大多数DNA操作，例如载体的切割，酶切图谱的制作，基因的鉴定与DNA片段的分离等。

1.1.3.3双酶切的解决方法

在DNA重组实验中，经常会用双酶切（甚至是3个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的DNA片段，而在厂商提供的联合酶切缓冲液表中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果，这里介绍两种通用的解决方法：

（1）分步酶切法对将进行的两种酶的酶切采用分步的方法，即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，酶切完全的DNA进行沉淀后再溶解，然后选用第二个酶进行最佳反应。

在酶切时，一般选择便宜的酶进行酶切沉淀，而后在进行第二个酶的酶切反应。

此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时，而且DNA在沉淀时后有部分损失，要求开始时DNA的投入量要比较高。

（2）同步酶切法取两种酶的最佳缓冲液各50％加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进行反应。

特别是对不同厂商提供的酶进行联合酶切时，即可节约时间也可取得比较好的酶切效果。

1.1.3.4酶切反应设计

在进行酶切反应时，首先要确定需切割的DNA量，根据DNA的量确定总反应体系和酶量（最多占1/10），一般体系如下：

total（l）ddH2O（l）10×Buffer（l）Enzyme（l）DNA（50ng/l）

2014.520.53

一般较好的酶切体系DNA的投入量不高于1.5g/50l，当DNA的投入量为1.5g/20l时酶切将发生困难。

加样顺序：

水-->缓冲液-->DNA-->酶。

各组分加完后要混合均匀，并用离心机低转速将溶液离心至管底。

1.1.3.4酶切失败的原因及处理办法

酶切失败主要表现为两方面：

（1）不完全酶切甚至是DNA基本未发生酶切；主要原因有：

a）缓冲体系不合适，可进行重新酶切；b）酶量加入过多而导致甘油抑制酶活，可将反应体系适当稀释；c）DNA样品杂质含量高，可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切

（2）DNA被降解（不成带状）；主要原因是DNA样品中含有痕量的DNA酶，建议重新抽提除去DNA酶。

1.2试剂与器材

1.试剂

（1）常用的限制性内切酶

（2）酶切缓冲液，购酶时附

（3）无菌双蒸水

（4）DNA样品

2.器材

（1）eppendorf管

（2）枪头

（3）恒温水浴

（4）移液器

1.3实验步骤

2DNA的凝胶电泳

摘要本单元主要介绍DNA电泳的基本原理及各种影响因素，学习制胶，电泳等基本分析技术。

2.1实验原理

DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。

根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：

（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。

（2）琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。

电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。

由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。

2.1.1琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。

琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。

表2-1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。

表2-1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围

琼脂糖/％

标准

高强度

低熔点

低粘度低熔点

0.3

0.5

700bp～25kb

0.8

500bp～15kb

800bp～10kb

1.0

250bp～12kb

400bp～8kb

1.2

150bp～6kb

300bp～7kb

300bp~7kb

1.5

80bp~4kb

200bp~4kb

2.0

100bp~3kb

3.0

500bp~1kb

4.0

100bp~500bp

6.0

10bp～100bp

由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。

随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：

（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；

（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）？

？

，适用于DNA大片段的分离。

（5）其它类型。

各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

2.1.2DNA电泳影响因素

DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。

而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。

电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：

DNA分子特性和电泳条件。

（1）DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

（2）DNA分子构型对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。

常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：

超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

（3）不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。

不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。

所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

（4）电场强度电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。

在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。

电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。

实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。

（5）溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。

当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。

这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。

因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。

（6）电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：

TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2.2。

一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。

表2.2常用DNA电泳缓冲液

缓冲液

存储液组成成份/L

特点及用途

TAE

50×

双链DNA分子的泳动速率比另两者快10%

242gTris

超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量

57.1ml冰乙酸

回收DNA片段时首选，大片段分离效果好

100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

缓冲容量小，过夜电泳不可选用

TBE

5×

小片段（<1kb）分离效果好

54gTris

回收效率差而不宜用于回收电泳

27.5硼酸

缓冲容量大，过夜电泳适合

20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

TPE

10×

磷酸盐在乙醇作用下析出，也不适合回收电泳

108gTris

缓冲容量大，过夜电泳适合

15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml）

40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

2.1.3DNA电泳上样缓冲液

电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下：

（1）螯合Mg2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。

（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。

而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。

（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。

目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓冲液，DNA样品中仅需加入1/10的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。

2.1.4DNA电泳上样量的控制

在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带即可观察到清晰结果，而对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。

而对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。

对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带，上样量即使超过10g条带也不会托尾，而单一条带（>10kb）当上样量超过200ng就有可能产生托尾现象。

2.1.5DNA电泳的标准分子量

目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于PCR产物鉴定的小分子Marker，也有常规用的大分子Marker，图2-1为TAKARA公司提供的DNA标准分子量电泳（示意）图。

图2-1常用的DNA标准分子量电泳图

2.2试剂与器材

1.试剂

（1）50×TAE电泳缓冲液

242.0gTris碱

100ml0.5mol/EDTA（pH=8.0）

57.1ml冰醋酸

（2）EB母液（1mg/ml）

称取一定量的EB溶于无菌水中，室温避光保存

凝胶中浓度为0.5g/ml

EB为强诱变剂，实验中要防止污染

（3）DNA标准分子量（自制）

片段大小依次为：

0.5，1.1，1.6，2.7，3.1，4.1，5.4，9.4和17

单次电泳电样量3～4l即可，回收电泳加倍

（4）10×Loadingbuffer（pH7.0）

EDTA50mM

甘油60%

XyleneCyanolFF（W/V）0.25%

BromophenolBlue（W/V）0

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