第五章 种子制备与菌种保藏.docx

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第五章种子制备与菌种保藏

第五章种子制备与菌种保藏

第一节种子制备（Inoculumdevelopment）

定义：

由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得供生产车间发酵罐接种的足够数量和优质质量的种子。

种子扩培的目的：

❑接种量的需要

❑菌种的驯化

❑缩短发酵时间、保证生产水平

种子的要求：

❑总量及浓度能满足要求

❑遗传表现型要稳定，不易退化

❑活力强，移种至发酵后，能够迅速生长

❑无杂菌污染

❑对环境条件要有比较大的承受能力

生产种子制备的一般流程

实验室阶段：

不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子制备。

生产车间阶段：

种子培养在种子罐里面进行，一般归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段的种子制备。

}几个概念

种子罐级数：

种子在种子罐中需扩大培养的次数。

发酵级数：

种子罐的级数加一。

接种量：

放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。

种龄：

生产种子的培养时间。

一、斜面种子的制备

1.斜面种子：

在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。

2.制备流程：

3.制备过程注意事项

（1）  琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5%

（2）营养液中最好不含易沉淀的固形物；

（3）装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3；

（4）灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水

（5）微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入

4.质量检查

（1） 外观检查

（2） 无菌检查

（3）摇瓶生产能力检查

5.影响斜面种子质量的因素

（1）原材料质量，水质，培养基pH，

（2）灭菌条件，

（3）接种量，

（4）培养室温度、湿度、通风、

（5）培养时间，

（6）有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯）

（7）冷藏条件

二、米粒种子（米孢子）的制备

}1.米孢子：

将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。

}2.米孢子制备工艺流程

}

}3. 制备过程注意事项

（1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连；

（2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度

（3）米粒不要碰到瓶塞；

（4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。

（5）保存：

冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存

4.质量标准

（1）无杂菌污染

（2）孢子数足够，发芽率高

（3）生产能力高

（4）真空干燥后含水量小于8%

5.影响质量的因素及控制（同前）

三、种曲的制备（培养材料用麸皮、米糠等，其余同米粒种子）

四、摇瓶种子的制备

1.摇瓶种子:

将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。

2.制备流程:

3.制备过程注意事项

（1）培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。

（2）培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50ml/250ml瓶，60-80ml/500ml瓶，90-110ml/750ml瓶，120-150ml/1000ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上；

（3）灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上。

（4）注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。

经常检查，皮带松弛时要紧一紧。

（5）注意摇床中心与边缘、上层与下层的温度。

4.质量检查：

（1） 菌体浓度：

外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。

（2）  菌体生长阶段：

显微镜检查细胞分化情况。

（3）代谢情况：

对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。

（4）  生产能力：

摇瓶发酵试验。

（5）  污染杂菌情况：

镜检及无菌试验检查

5.影响质量的因素（同前）

五、发酵罐种子的制备

1.制备流程：

       斜面、摇瓶或米粒种子

↓

培养基配制→实罐或连续灭菌→冷却→火圈或压力差接种

→培养→发酵罐种子

2.制备过程注意事项

1）培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基

丰富，控制培养基成份的合理配比，

2）接种方式：

一级种子罐：

火圈保护接种法和压差法

二级种子罐：

压差法

3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50℃），搅拌转速也要适当。

4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵

5）通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围

6）控制合适移种量：

确定合适的移种量：

过大或过小都对发酵有不利影响

掌握种子罐的放罐体积。

移种方式：

}3.质量检查及质量标准：

1）不污染杂菌

2）菌体生长阶段（种龄）：

处于对数生长期后期，菌体量未达到高峰

3）菌体浓度：

菌体浓度的测定方法：

离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等

4）糖、氮、磷代谢情况

5）种子液pH

6）摇瓶试验的发酵水平

7）特异性酶活力

}4影响质量的因素（同前）

}5种子代谢缓慢原因分析

空气温度偏低

局部烫伤

培养基原材料质量差

培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多

无机磷量低

接种量太小

前一级种子质量太差

泡沫多通气差

第二节菌种保藏（strainconservation）

定义：

将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。

中国微生物菌种保藏中心

}普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）

中国科学院微生物研究所，北京

中国科学院武汉病毒研究所，武汉。

}农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）

中国农业科学院土壤肥料研究所，北京。

}工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）

中国食品发酵工业科学研究所，北京。

}医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）

中国医学科学院皮肤病研究所，南京

中国药品生物制品检定所，北京。

中国预防医学科学院病毒学研究所，北京

}中国抗生素菌种保藏管理中心（CACC）

中国医学科学院医药生物技术研究所，北京；

四川抗生素工业研究所，成都；

华北制药集团抗生素研究所，石家庄。

}兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）

中国兽医药品监察所，北京。

}林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）

中国林业科学研究院，北京。

}中国典型培养物保藏中心（CCTCC）

武汉大学，武汉。

}AmericanTypeCultureCollection（ATCC）,UnitedStatesofAmerica.

}NationalCollectionofTypeCultures（NCTC）,UnitedKingdom.

}InstituteforFermentation,Osaka（IFO）,Japan.

}二、常用的菌种保藏方法

}1单纯传代保存法（斜面或穿刺）

}4℃冰箱或15℃室温，保存期3-6个月

}适用于细菌或酵母

}2结合单孢子分离的传代保存法

}斜面→孢子悬浮液→稀释涂布→单细胞分离培养

}→挑菌→高产菌株的筛选→高产菌株的保藏

}4℃冰箱或15℃室温，3-6个月

}适用于遗传不稳定的菌种,既保藏了菌种，又保持了生产能力

}3米孢子保存

}密封，4℃冰箱3-6个月；真空抽干后密封，保藏6-12个月。

}适用于霉菌的保藏

}4庭院土保藏法

}灭菌庭院土为保藏介质，培养，真空干燥，密封

}4℃冰箱一年以上保存期

}适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏

}5沙土管保存

}过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，接种，

}真空干燥、密封，4℃冰箱保存，1-3年保存期。

}适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏

}6孢子或营养细胞悬浮液保存

}悬浮于灭菌的10%-20%甘油介质，

}低温冰箱（-50--70℃）1-2年

}7冷冻干燥管保存（lyophilizationfreeze-drying）

8液氮管保存（storageinliquidnitrogen）

9基因工程菌的保藏

}由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。

质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。

}一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。

}当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。

而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。

}我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。