绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究.docx

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绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究

谢广发，李旺军，方华，曹钰，陆健，胡志明，邹慧君

摘要：

采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。

富集后的图谱中只有4条带在免培养图谱中能找到对应的位置。

通过土豆培养基、察氏培养基和麦曲浸提液培养基对麦曲中的真菌进行分离，共得到24株真菌。

三种培养基分离得到的纯种数目和菌落数分别为8种、18种、11种和4.7×104cfu/g曲、1.4×104cfu/g曲、8.4×104cfu/g曲。

不同的培养基分离出来的优势菌不一样，每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。

必须联合使用多种培养基才能最大限度和更加准确的分离和了解麦曲中的真菌及其群落结构。

关键词：

绍兴黄酒；麦曲；微生物群落结构；DNA提取；核糖体基因间隔区分析（RISA）

前言

麦曲在黄酒的酿造过程中起着非常重要的作用。

它是在一定的地理环境和生长条件下，通过制曲工艺的驯化，其中的微生物不断的发生着有序的消长和变化，逐步形成稳定的微生物区系。

分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理解制曲过程中的微生物和周边环境的相互关系，建立麦曲微生物生态数据库，实现麦曲微生态系统的人工模拟和异域再现具有重要的指导意义。

国内对黄酒麦曲中的微生物尤其是真菌从筛选产酶的角度进行过研究，通过传统的分离培养方法[1]对真菌的种类进行分类鉴定，操作方法繁琐、周期较长，而且对鉴定者经验要求较高。

而对于麦曲中的微生物群落结构以及微生物种群之间的相互影响的关系，即微生物生态还未见研究报告。

目前，微生物生态学的研究有两个主要趋势：

一方面，结合传统研究方法和各种分子生物学技术对不同环境的微生物群落进行研究，使人们能更加客观地认识环境中微生物的自然存在状况；另一方面，加强对各种复杂环境微生物的研究，希望从中发现更多新的微生物及基因资源，了解微生物对特定环境的适应机制，为合理利用和保护微生物资源奠定基础。

因此，本章采用不同的培养基对黄酒麦曲中可培养真菌进行系统分离和初步研究，同时比较不同培养基的分离能力。

通过大规模的平板稀释分离，将得到的不同种的真菌采用扩增真菌的内转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）保守序列，测定其序列组成，然后通过序列比对的方式对未知真菌进行鉴定。

另外，采用免培养的方法对麦曲中的真菌进行分离鉴定，通过比较，以综合利用这两种方法，更加客观准确地了解和掌握麦曲中真菌的群落结构。

1.材料与方法

1.1麦曲样品的收集与保存

黄酒麦曲样品采自绍兴黄酒厂某分厂的成品麦曲JH。

样品采集完成后转入无菌塑料袋中带回实验室。

分别取两块平行样品，粉碎，混合均匀，得到均一样品后，称取500g放入塑料袋中，保存于4℃备用。

1.2分离培养基

土豆琼脂培养基（PDA）：

马铃薯200g、葡萄糖20g、定容至1000mL、pH自然。

察氏培养基（CPK）：

NaNO3,2g、K2HPO4,1g、KCl,0.5g、MgSO4·7H2O,0.5g、FeSO4·7H2O,0.01g、蔗糖30g、定容至1000mL。

麦曲浸提液培养基（WQE）:

500g粉碎的麦曲样品，加入1500mL蒸馏水，100℃煮沸1h后，用四层纱布过滤，0.1MPa下灭菌20min备用[2]。

三种培养基中均添加去氧胆酸100mg/L、链霉素3×104U/L分别抑制菌丝的蔓延和细菌的生长，各培养基的固态培养基琼脂的添加量均为15g/L，0.1MPa下灭菌20min。

1.3分离培养条件

取10g均一麦曲样品，加入到90mL磷酸盐缓冲液中（PBS,137mmol/LNaCl,2.7mmol/LKCl,4.3mmol/LNaH2PO4·7H2O,1.4mmol/LKH2PO4,pH7.0），轻轻振荡10min。

取上清液分别用PBS作梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。

平板稀释分离：

取不同稀释度的样品100μL，分别涂布于对应的固态培养基上，每个稀释度作五个平行。

其间进行平板菌落计数，表示单位为cfu/g干曲。

然后根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，分离纯化，得到纯种菌株。

液态培养基富集：

取不同稀释度的样品1mL分别接入（接种量为10%,v/v）到装有9mL各种培养基（PDA,CPK和WQE）的试管中，在30℃下振荡培养2天。

1.4分离获得的真菌的鉴定

1.4.1真菌基因组DNA的提取

采用氯化苄抽提真菌DNA[3]：

用接种环刮取一环纯种斜面的孢子于土豆液体培养基中，30℃摇瓶过夜。

将摇瓶培养物抽滤后，收集菌丝体，超纯水洗涤3遍后，转入7mL离心管中，加入2.5mL提取液（100mmol/LTris-HCl，pH8.0;40mmol/LEDTA，pH8.0;2%SDS）振荡混匀后，再加入1mL10%SDS和2mL氯化苄，50℃保温1h（每10min上下颠倒混匀），加入1mL3mmol/L的NaAc，冰浴15min，9,800×g离心15min，取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置20min，9,800×g离心15min，弃上清，加入70%乙醇洗涤，离心15min，弃上清，室温放置15min后，加入50µLTE溶解。

0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.2ITS-PCR扩增

真菌的ITS（内转录间隔区）序列扩增参照White等[4]的方法。

采用引物对pITS1：

5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，pITS4：

5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’来扩增真菌的ITS保守序列。

PCR扩增的反应体系为：

50µL的总反应体积中含有1µLdNTP（10mmol/L），5µL10×Buffer，10mmol/L的MgCl2，2.5U的Taq酶（上海申能博彩生物技术公司），引物pITS1、pITS4各10pmol/L，DNA模板量1μL。

扩增条件：

95℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照。

1.4.3ITS-PCR产物胶回收

割下含目的DNA片段的琼脂糖凝胶（尽量小），放入1.5mL的离心管中，采用小量琼脂糖胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）对PCR产物进行纯化，具体操作步骤见说明书。

1.4.4PCR纯化产物与pUCm-T载体连接

连接体系为10µL。

在微型离心管中加入以下成分：

1.0µL的10×连接酶缓冲液和1.0µL的T4连接酶，pUCm-TVector1.0µL，纯化后的PCR产物7.0µL。

16℃连接过夜。

1.4.5转化

采用CaCl2法预先大量制备E.coliJM109的感受态细胞，取出一支100µL已制备好的保存在-70℃超低温冰箱中的感受态大肠杆菌，放在冰上，加入DNA连接液10µL，冰上放置30min。

然后42℃,热击90s。

取出0℃，放置2min。

加入LB液体培养基400µL，37℃摇床150r/min，振荡培养45min。

将离心管中的液体9,800×g离心1min，用枪吸掉300µL，剩余的菌液用枪混匀后全部涂布在含Amp、IPTG、X-Gal（终浓度均为100mg/mL）的LB固体平板上，37℃培养过夜。

1.4.6阳性克隆子的挑选与质粒抽提

观察培养皿上的转化子的生长状况，在超净台上用接种针从每个培养皿上挑取5个白色克隆子，接入含有Amp+（终浓度均为100mg/mL）的LB液体培养基小试管中，37℃，180r/min摇床上培养8h。

将培养好的细菌全部倒入2mL的离心管中，9,000×g离心1min。

弃上清，得到菌体进行质粒抽提，具体操作步骤见说明书。

提取的质粒放在-20℃保存备用。

1.4.7质粒PCR法验证插入片段

以上述抽提的质粒为模板，用质粒PCR法验证插入片段是否有插入片段。

PCR扩增条件参照1.4.2。

1.4.8序列测定

将含插入片段的质粒，送往宝生物（大连）生物工程公司进行序列测定。

1.4.9系统发育学分析

从NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库中选取一些已知的序列，采用ClustalX软件（ver.1.8）将已知序列和测得的序列进行多重序列比对，比对完成后用MEGA生物软件（ver3.1）中的邻接法构建系统发育树。

1.5麦曲中真菌的核糖体内转录基因间隔区分析（RISA）

1.5.1免培养法和液态富集培养后菌体总DNA的提取

免培养法：

称取1.0g均一的麦曲样品于7mL离心管中，加入提取缓冲液，采用氯化苄抽提样品的总DNA。

具体操作方法参照1.4.1。

液态富集培养法：

液态培养结束后，菌悬液于10,000×g离心10min收集菌体，总DNA的提取方法参照1.4.1。

1.5.2麦曲样品的RISA图谱分析

以1.5.1方法中得到的总DNA为模版分别进行PCR扩增，具体扩增条件参照1.4.2。

PCR产物经PCRPurificationKit（上海华舜生物工程有限公司）纯化后，进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

100V电泳12h。

电泳结束后，溴化乙锭染色15min。

去离子水洗15min，紫外系统成像拍照后，用手术刀割下胶中的各条带，放置于1.5mL的离心管中，供回收DNA使用。

1.5.3回收条带的克隆和序列测定

在装有回收条带的离心管中加入50µL的洗脱缓冲液[5]（500mmol/L乙酸铵，10mmol/L乙酸镁，1mmol/LEDTA，0.1%SDS），37℃水浴5h，12,000×g离心10min，取上清，用PCRPurificationKit回收DNA。

然后以纯化的DNA为模板，进行克隆测序，以下操作步骤参照1.4.4-1.4.8所述。

1.5.4ITS序列的比对和同源性分析

测序结果经DNAMAN3.0软件去载体后，将序列提交GenBank数据库，利用Blastn软件进行序列比对，将所得序列提交GenBank数据库获得登录号。

2．结果与讨论

2.1不同培养基上真菌的平板分离结果

为了最大限度的分离出麦曲中的真菌，本章采用了三种培养基，其中PDA和CPK培养基是用来分离真菌的常用培养基，此外还使用了麦曲浸提液培养基（WQE），因为它的营养成份与麦曲最相似，近似于微生物最原始的生存环境。

对三种培养基进行平板菌落计数，结果见图1。

从图1中可以看出，随着培养时间的延长，菌落数逐渐增加，三种培养基上菌落的增长趋势相同。

PDA和WQE培养基上的菌落数48h后达到最大，菌落数分别达到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。

而在CPK培养基上，由于本身是合成培养基，营养不够丰富，所以24h后开始慢慢形成菌落，56h后达到最大值，仅为1.4×104cfu/g干曲。

三种培养基相比，WQE所得到的菌落数最多，CPK培养基上得到的菌落数最少。

图1三种培养基中真菌菌落形成数随着培养时间的变化曲线

结果表示为平均值±标准偏差

2.2麦曲真菌在不同培养基上的分布

根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，共得到24株纯种菌株。

各个纯株在三种分离培养基上的分布情况见表1。

结果显示，从PDA，CPK和WQE三种培养基上分离得到的纯种真菌分别为8种，18种和11种。

PDA是营养丰富的培养基，但分离出来的真菌数目最少。

而近似于微生物最原始生存环境的WQE培养基分离得到的真菌种类不如预想的多。

在合成培养基CPK上分离获得的真菌种类最多，暗示在低营养长时间的培养条件下，能够较多的回收得到麦曲样品中的真菌，这一结果与有关文献的研究类似[6]。

据报道，有些微生物长期处于营养贫瘠的环境中，已经习惯了周围贫瘠的生长环境[7]，因而用营养丰富的培养基反而得不到某些纯培养物。

将10-5稀释度以上检测到的真菌认为是麦曲样品中的优势菌。

从表中可以看出，不同的培养基分离出来的优势菌是不一样的，也就是说培养基的选择性使得分析的样品中优势菌的组成随着所采用的分离培养基的不同而变化。

表中的结果还显示，每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。

所以单单使用一种培养基分离麦曲中的真菌是不够充分的，必须联合使用多种分离培养基，才能准确解析麦曲中的真菌多样性。

另外，在分离培养基中加入去氧胆酸钠来抑制菌丝的蔓延是非常有必要的，否则，霉菌的菌丝生长过快，使得其它一些真菌的分离纯化十分困难，尤其是在较低的稀释度上更为明显。

表1不同培养基分离麦曲中优势真菌的比较

菌株编号

不同纯种在三种培养基中最高稀释度上的分布情况

PDA

CPK

WQE

10-6

10-4

10-3

10-6

10-3

10-5

10-4

10-3

F10

10-6

10-4

F11

10-3

F12

10-3

F13

10-3

F14

10-3

F15

10-6

F16

10-5

F17

10-5

10-4

F18

10-5

10-6

10-5

F19

10-3

F20

10-3

F21

10-4

F22

10-3

F23

10-3

F24

10-3

nd表示对应的菌株在当前实验条件下（10-3，10-4，10-5和10-6）没有检测到；

2.3纯种真菌的鉴定

对分离获得的24株真菌纯株进行形态初步鉴定和基于ITS序列的分子鉴定。

形态初步鉴定的具体操作步骤如下：

在洁净载玻片上，挑取较嫩的菌丝体，滴加95%乙醇1-2滴，洗去部分孢子。

再滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液1滴，将菌丝体充分打散，加盖玻片，注意不要产生气泡，并不再移动盖玻片，用显微镜进行观察，40倍镜下拍摄真菌的形态。

纯种菌株的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示。

从图中可以看出，提取获得的各株基因组DNA条带约为20kb。

图2氯化苄法提取24株真菌的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱

分别以各株的基因组DNA为模板，用引物ITS1和ITS4通过PCR反应，成功扩增出所有纯种真菌的ITS片段，大小分布在200bp-750bp之间，如图3所示。

图324株真菌PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

通过三种培养基平板稀释分离得到的24株真菌的测序结果，见表2。

序列的相似性超过99%以上，可以认为已经鉴定到种的水平[8]。

一般认为，ITS区序列进化速率较快，其基因序列和长度存在显著的株间差异，即使是同种的两株不同菌株相似性相差也较大，因此，ITS常常用来作为属或种以下的分类学指标[9]。

从表2中可以看出，F1，F7序列的相似性分别只有98%和97%。

另外，F22菌株与数据库中已存在的序列相似性只有92%，远远低于种间水平的允许差异标准。

分析原因可能是部分真菌由于进化，变异等缘故，在ITS间隔区上表现出差异性[10]。

这些序列所对应的菌株后面都加上“like”表示近似种。

从平板计数和测序的结果可以看出，CPK培养基分离曲霉属真菌的能力较强，尤其是对于含量偏低的各种曲霉的分离。

证实在低营养长时间培养条件下，从麦曲样品中回收得到的真菌更多。

综合平板分离和测序的结果可以看出，通过大规模的系统分离培养方法确定的麦曲中的优势真菌为：

伞枝犁头霉（Absidiacorymbifera-like），米曲霉（Aspergillusoryzae），烟曲霉（Aspergillusfumigatus）,黑曲霉（Aspergillus.niger），小孢根霉（Rhizopusmicrosporus），微小根毛霉（Rhizomucorpusillus）,季氏毕赤氏酵母（Pichiaguilliermondii）和异常毕赤酵母（Pichiaanomala）。

另外，分离鉴定出的焦曲霉（Aspergillusustus），土曲霉（Aspergillusterreus-like），泡盛曲霉（Aspergillusawamori），桔青霉（Penicilliumcitrimum），季氏毕赤酵母，异常毕赤酵母，小孢根霉，多变根毛霉（Rhizomucorvariabilis），球毛壳霉（Chaetomiumglobasum），阿姆斯特丹散囊菌（Eurotiumamstelodami）和Phaeosphaeriafuckelii菌株在以前的研究结果中均未出现。

方华[11]采用培养法对机制麦曲ZJ中的真菌进行过研究，认为其中的优势真菌为伞枝犁头霉（Absidiacorymbifera）、米根霉（Rhizopusoryzae）、微小毛霉（Rhizomucorpusillus）、米曲霉（Aspergillusoryzae）、烟曲霉（Aspergillusfumigatus），但没有分离获得酵母。

除了米根霉以外，其余真菌与本文的研究结果一致。

造成这种差异的主要原因可能有两个，第一是两种麦曲的成型方式不一样；本文所用的麦曲是人工脚踏成型，制曲过程中曲坯较松软，比机械压制成型的更适合微生物的生长繁殖。

第二是麦曲制作时所处的地理环境有差异；由于麦曲中的微生物来源与周边的空气，制曲所用的水和小麦原料以及制曲工具等有关，从而导致成品麦曲中真菌的种类有所不同。

表.2通过培养法从麦曲中分离得到的菌株的部分ITS序列鉴定结果

菌株编号

ITS片段长度（bp）

最相似菌株

相似性（%）a

登录号

784

Absidiacorymbifera-like

EF151426

701

Absidiacorymbifera

100

EF151427

552

Aspergillusoryzae

100

EF151428

590

Aspergillusoryzae

100

EF151429

404

Aspergillussydowii

100

EF151430

454

Aspergillusustus

100

EF151431

533

Aspergillusterreus-like

EF151432

534

Aspergillusfumigatus

100

EF151433

549

Emericellanidulans

100

EF151434

F10

618

Aspergillusniger

100

EF151435

F11

600

Aspergillusawamori

100

EF151436

F12

565

Penicilliumoxalicum

100

EF151437

F13

493

Penicilliumcitrimum

100

EF151438

F14

549

Cladosporiumcladosporioides

100

EF151439

F15

684

Pichiaguilliermondii

100

EF151440

F16

635

Pichiaanomala

100

EF151441

F17

694

Rhizopusmicrosporus

100

EF151442

F18

624

Rhizomucorpusillus

100

EF151443

F19

613

Rhizomucorvariabilis

100

EF151444

F20

511

Chaetomiumglobasum

EF151445

F21

550

Eurotiumamstelodami

100

EF151446

F22

556

Phaeosphaeriafuckelii-like

EF151447

F23

449

Issatchenkiaorientalis

100

EF151448

F24

367

Candida（Clavispora）lusitaniae

100

EF151449

a分离得到的纯种菌株序列与GenBank数据库最相似的序列的相似性；

对分离获得的真菌纯株序列进行系统发育分析，结果见图4。

从图中可以看出，所分离得到的纯种菌株大致分为11个属，分别是曲霉属（Aspergillus），犁头霉属（Absidia），根霉属（Rhizopusmucor），毛霉属（Rhizopus），青霉属（Penicillium），散囊菌属（Eurotium），枝孢属（Cladosporium），毕赤酵母属（Pichia），球毛壳属（Chaetomium），念珠属（Candida）和伊萨酵母属（Issatchenkia），反映出绍兴黄酒成品麦曲中真菌的资源非常丰富。

从属的分类水平来看，在脚踏曲中出现的属除了散囊菌属（Eurotium），毕赤酵母属（Pichia）和球毛壳属（Chaetomium）外，其它的属在机制曲[11]中均有出现。

图4绍兴黄酒麦曲中分离得到的真菌的ITS序列系统进化树

本文所得到的序列用菌名加代号表示，来自于GenBank数据库的序列用菌名加登录号表示。

比例尺代表5%的核酸序列差异性。

2.4基于核糖体内转录基因间隔区分析（RISA）麦曲中的真菌群落构成

通过免培养法和三种培养基液体富集培养后的麦曲真菌群落的核糖体内转录基因间隔区分析指纹图谱如图5所示。

从图中可以看出，免培养法提取麦曲中微生物总DNA显示了9条带，其中条带8,5,4和3亮度最高。

经过三种培养基液体富集培养后，没有任何一种富集培养基所产生的RISA指纹图谱与免培养法得到的图谱相同。

培养法中所产生的RISA指纹图谱条带数目比免培养法的少。

此外，在培养法中，三种培养基所显现的指纹图谱彼此也有差异。

在同一稀释度上，不同的指纹图谱表明三种培养基所分离得到的真菌类型不同，这与分离培养的结果相一致。

图5分别采用免培养法和培养法得到DNA经ITS-PCR后的核糖体内转录基因间隔区分析（RISA）

每一泳道上面的数字表示三种培养基的稀释梯度；T表示采用免培养法从麦曲中得到的RISA指纹图谱

免培养法中的部分条带在三种培养基中均能找到对应的条带，在凝胶上迁移到相同的位置（PDA中的条带3和6；CPK中的条带3,4,5和8；WQE中的条带3,4,5,6和8）。

从培养法的RISA指纹图谱中可以看出，随着稀释度的增加，条带数目逐渐减少。

在最高稀释度上（10-6），只有一条或两条带，分别是PDA中的条带3，CPK和WQE中的条带4,5，这些条带在免培养中均有对应的条带，但在CPK培养基上，出现了一些非常弱的条带。

在WQE培养基的10-4稀释度

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