生物技术制药深刻复习资料熊宗贵.docx
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生物技术制药深刻复习资料熊宗贵
第二章生物药物概论
一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。
主要原则:
有效成分含量高,原料新鲜;来源丰富,易得;原料产地较近;杂质含量少;原料成本低;易提取。
特性:
(1)药理学特性:
治疗的针对性强;药理学活性高;毒副作用小,营养价值高;生理副作用常有发生。
(2)生产、制备中的特殊性:
原料中的有效物质含量低;稳定性差;易腐败;注射用药有特殊要求。
(3)检验上的特殊性:
要有理化检验指标,和生物活性检验指标。
分类:
按药物化学本质和化学特性分类:
(1)氨基酸及基衍生物类
(2)多肽和蛋白质类(3)酶和辅酶类(4)核酸及其降解物和衍生物类(5)糖类(6)脂类(7)细胞生长因子类(8)生物制品类(9)小动物制剂(10)动物器官或组织制剂。
按原料来源分类:
(1)人体组织
(2)动物组织(3)植物组织(4)微生物(5)海洋生物来源的药物。
按生理功能和用途分类:
(1)治疗药物
(2)预防药物(3)诊断药物(4)其他。
2、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。
在对生物药物进行提取操作时,选择提取试剂需注意的问题。
工艺流程:
1、生物药物原料的选择、预处理与保存(保存方法:
冷冻法,-40℃;②有机溶剂脱水法;③防腐剂保鲜,多用于液体)。
2、生物药物的提取:
(1)生物组织与细胞破碎:
磨切法,压力法,反复冻融法,超声波震荡破碎法,自溶法,酶溶法
(2)选择合适的溶剂进行提取(考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数,注意温度、变性剂等因素)。
3、生物药物的分离纯化:
(1)蛋白质类药物的分离纯化:
沉淀法,亲和层析法,疏水层析法
(2)核酸类药物的分离纯化:
提取法,发酵法(3)糖类:
沉淀法,离子交换层析法(4)脂类:
沉淀法,吸附层析法,离子交换层析法(5)氨基酸类:
沉淀法,吸附法,离子交换法。
试剂的选择:
1、对所需要提取的活性成分溶出度较高,对杂质较低。
2、不破坏活性成分。
3、利于后续预处理。
4、对环境影响较小,有利于回收和处理。
5、对设备要求不高。
6、成本较低。
7、最好对人体无害。
第三章基因工程制药
一、基因工程制药的主要工艺过程。
获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌(或细胞)→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装
2、什么是目的基因?
有几种获取方法?
用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求?
目的基因既是人们所需要的特定基因,一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。
获取方法:
(1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因文库,从中调用目的基因;
(2)以mRNA为模板,反转录合成互补的DNA片段;(3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增所需要的目的基因片段(4)化学合成法;⑸逆转录(RT)-PCR法合成cDNA。
基本要求:
不含多余干扰成分,纯度高;片段大小适合重组操作;结构、序列正确,达到一定数量。
三、基因工程克隆细胞和表达细胞、克隆载体和表达载体其各自特点。
克隆载体:
1、具备复制原点,在宿主细胞内必须能够自主复制。
2、有一个或多个用于筛选的选择标记。
3、具备合适的限制性核酸内切酶的单一识别位点。
4、有较高的拷贝数。
表达载体:
要使克隆基因在宿主细胞中表达,就要将他放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中,这种载体就成为表达载体。
表达载体的结构比克隆载体复杂,除了必须具备与克隆载体相同的复制原点,多克隆位点和筛选标记基因以外,还必须有控制目的基因表达的调控序列,包括启动子,转录终止子等。
四、目的基因高效表达的方式有哪些?
怎样全面提高目的基因的表达水平?
有何措施?
目的基因高效表达的方式:
1.目的基因的不溶性高效表达。
表达的蛋白质往往形成不溶性的无生物活性的包涵体,需要经过溶解和复性才能获得有活性的目的蛋白。
2.目的基因的高效可溶性表达。
可溶性的目的蛋白本身常具有生物活性,无需复杂的变性复性的后分离过程,是一种很有希望的提高目的基因表达的新策略。
3.目的基因的高效分泌型表达。
目的基因的分泌型表达有两种情形:
目的蛋白分泌到细胞周质中和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外。
对于能分泌到细胞外的表达系统,能进一步简化产物分离工艺。
提高目的基因表达水平的措施:
1.对基因工程宿主菌进行改造。
如在上游阶段通过改造宿主的遗传性能从而减少或消除乙酸的生成;通过改造大肠杆菌使之能在贫氧条件下生长。
2.提高工程菌的质粒稳定性。
如在上游阶段质粒构建时插入抗生素抗性基因;在质粒构建时应该加入称为par和cer的位点(par位点能够在细胞分裂过程中使质粒分布更均匀,cer位点则能够防止多聚体质粒的形成,从而能从源头上提高质粒稳定性)。
在下游阶段采用细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培养策略,另外还可采用培养条件循环控制策略和采用固定化细胞培养等。
3.选择能高密度表达的宿主菌和对重组菌进行高密度培养。
如选择培养时菌体密度和表达水平能尽可能高的宿主菌。
在下游阶段赋予工程菌生长和产物表达的最适环境条件。
4.减少乙酸等抑制性副产物的形成。
如在下游阶段设计好培养基的组成;选取合适的比生长速率;适当降低培养温度;限制性流加葡萄糖;将基因工程菌培养和乙酸的分离同时进行等。
5.选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌以及能提高目的蛋白表达质量的方法。
如在上游阶段选择尽可能地不产生或少产生能引起蛋白质变性或降解的酶系的宿主细胞。
而在下游阶段可采用将菌体生长与蛋白表达时期分开的策略。
(也可以分上、下游表述为:
上游----对基因工程宿主菌进行改造;提高工程菌的质粒稳定性;选择能高密度表达的宿主菌;选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌。
下游----提高工程菌的质粒稳定性;对重组菌进行高密度培养;减少乙酸等抑制性副产物的形成;选择能提高目的蛋白表达质量的方法。
)
五、工程菌的稳定性及其影响因素和考察方法。
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性,这种不稳定性具有下列两种表现形式:
1.结构不稳定性:
重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰导致其表观生物学功能的丧失。
2.分配不稳定性:
整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸。
影响基因工程菌稳定性的因素:
遗传特性:
1.载体的选择2.宿主的选择3.外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺:
1.培养基2.生长速率3.限制性机制4.温度5.pH和溶氧6.外源基因表达
六、基因工程菌的常见培养方式及其各自特点有哪些?
连续式发酵对基因工程产品的大规模生产有什么优势?
影响基因工程菌发酵的因素。
基因工程菌构建和基因工程菌生产其发酵研究各自的目的、意义及相应研究内容。
培养方式:
分批培养,补料分批培养,连续培养,透析培养,固定化培养。
补料分批培养将种子接人发酵反应器中进行培养,经过一段时间后,间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的培养方法。
连续培养将种子接人发酵反应器中,搅拌培养至一定菌体浓度后,开动进料和出料的蠕动泵,以控制一定稀释率进行不间断的培养。
透析培养透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离,通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。
固定化培养即将固定化技术应用于基因工程菌培养,基因工程菌经固定化后,质粒的稳定性大大提高,便于进行连续培养,特别是对分泌型菌更为有利。
连续培养可为微生物提供恒定的生活环境,控制其比生长速率,可为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造良好条件。
在连续式培养中,还可以将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开进行两阶段连续培养,并通过优化诱导水平、稀释率和细胞比生长速率这3个参数,可以保证在第一阶段培养时质粒稳定,在第二阶段可获得最高表达水平或最大产率。
影响基因工程菌发酵的主要因素:
1、培养基的影响。
2、接种量的影响。
3、温度的影响。
4、溶解氧的影响。
5、诱导时机的影响。
6、诱导表达程序的影响。
7、pH的影响
基因工程菌发酵研究内容:
1、选择宿主菌:
研究不同宿主菌对外源基因表达的影响2、基因工程菌的生长曲线测定3发酵条件对外源基因表达的影响4、重组质粒稳定性研究。
七、以包涵体表达形式的基因工程药物的分离纯化过程和方法,分离纯化出具有活性的蛋白质的一般步骤及其操作要点。
进行分离纯化研究涉及到的研究项目及内容。
过程方法及操作要点:
1、菌体细胞的收集与破碎(既要使菌体破碎率尽可能高,又要保持包涵体的完整性)。
2、包涵体的分离、洗涤与溶解(通过离心法使包涵体与上清液中的碎片及杂质蛋白分开,包涵体洗涤的基本原则是杂质去除率尽可能高而不溶解包涵体中的目的蛋白。
溶解包涵体的试剂选择基本原则是对目的蛋白的溶解性强、选择性好;保护蛋白质的生物活性;安全性;适合后续各种操作;成本低)。
3、变性蛋白的纯化(对包涵体抽提物采用柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分离纯化)。
4、蛋白质的复性(恢复可溶性和生物活性,应考虑影响因素:
蛋白质浓度、杂质含量、冲折叠速度、氧化还原剂用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH、离子强度等)。
分离纯化研究:
1、破菌研究:
破菌方法及其条件研究,镜检评价其破碎效果,原则是使菌体破碎率尽可能高,又要保持包涵体的完整性
2、包涵体的分离和洗涤研究:
(1)分离包涵体时的离心力和时间的考察;
(2)洗涤剂及其他浓度、用量研究;(3)洗涤时间和温度研究。
包涵体洗涤操作的基本原则:
(1)洗涤剂杂质去除率尽可能高,而不溶解包涵体中的目的蛋白;
(2)分离包涵体时的离心力和离心时间尽可能满足将包涵体与细胞碎片等杂质很好地分离。
3、目的蛋白的变性(抽提)研究:
(1)变性剂及其浓度、用量的研究
(2)变性操作时间和温度研究(3)变性操作后的固液分离(离心力和离心时间)研究。
4、变性蛋白的纯化研究:
对包涵体抽提物可采取柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分离纯化。
Ps:
重组蛋白的纯化可以在包涵体溶解后进行,也可以在复性后进行,因此还应进行两种方法的对比研究。
5、变性蛋白的复性研究:
考察比较不同复性方法对目的蛋白复性效果的影响。
主要考察其对蛋白回收率和复性程度的影响;另外,还需要考察复性时间的影响因素,如蛋白质浓度、杂质的含量、重折叠速度、氧化还原剂的用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH值和离子强度等对复性效果的影响。
6、目的蛋白的高度纯化研究:
对经复性后得到的目的蛋白进行进一步高度纯化,以满足不同的需要。
八、基因工程药物质量控制的必要性及其质控要点,基因工程药物最终产品的质量控制特点及要点。
必要性:
1、它是利用获得细胞作为表达系统来制备产品,所获得的蛋白质往往分子量较大,并且具复杂的表达结构;
2、许多基因工程药物都是参与人体一些生理功能精密的蛋白质,在极微量的差别的情况下产生显著效应;
3、宿主细胞中表达的外源基因在翻译、转录及工艺放大的过程中会产生变化。
质控要点:
1、原料的质量控制。
确保编码药品的DNA序列正确性,重组微生物来自单一克隆,所用的质粒纯而稳定。
2、生产的质量控制。
原始细胞库生产、有限代次的生产、连续培养生产、分离纯化。
3、最终产品的质量控制。
产品的鉴别、纯度分析、生物活性测定、安全性稳定性考察和产品一致性的保证。
质控特点:
任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求,它需要综合生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论和技术,才能切实保证基因工程产品的安全有效。
第四章酶工程制药
一、酶工程制药的主要内容
1、药用酶的生产:
发酵生产,分离纯化,分子修饰
2、酶法制药:
酶催化反应、固定化、非水相催化
二、酶法制药研究中涉及到的研究项目及内容
1、原料的选择及反应的研究。
2、酶或酶系的选择研究。
3、酶催化反应最佳工艺条件研究。
4、产物的分离纯化研究
第五章植物细胞培养制药
一、植物细胞的生理特性,植物细胞培养的基本流程和技术。
生理特性:
1、比微生物细胞大得多;
2、具有群体生长特性,单细胞难以生长,繁殖;
3、对剪切力敏感,抗张力强度大,抗剪切力小;
4、生长速度慢,操作周期长;
5、容易结成细胞团;
6、大多植物细胞的生长及次级代谢物的生产都要求一定的光照和时间,且不同波长的光具有不同的效果。
基本流程:
1、外植体的获得及预处理;2、获得悬浮细胞株3、悬浮细胞株筛选4、植物细胞的扩大培养;5、大规模培养
基本技术:
1、植物细胞的获得技术;2、植物细胞的选育与改良技术;3、植物细胞培养技术;4、植物细胞培养次级代谢产物技术;5、植物细胞培养生物转化技术
二、植物细胞获取的主要方法及其操作过程,植物细胞培养制药的培养方法。
愈伤组织培养的基本过程和操作。
主要方法:
从外植体直接分离,愈伤组织诱导获取,原生质体再生
操作过程:
1、外植体的选择与预处理。
选择时需综合考虑的因素有外植体大小、同一植物不同部位的选取、不同物种的选择、植物年龄以及取材季节。
注意灭菌剂和灭菌时间选择以及灭菌后无菌水洗。
2、直接分离:
(1)机械捣碎法:
先将外植体轻轻捣碎,然后通过过滤和离心分离细胞;
(2)酶解法:
利用果胶酶,纤维素酶等处理,分离出具有代谢活性的细胞。
3、愈伤组织诱导法:
(1)诱导培养基的制备
(2)外植体植入诱导培养基中培养生成愈伤组织(3)愈伤组织继代培养(4)从愈伤组织分离得到植物细胞。
4、原生质体再生法(不要求)。
培养方法:
按培养对象分:
愈伤组织培养,原生质体培养,小细胞团培养
按培养基类型分:
固体培养,液体培养
按培养方式:
悬浮细胞培养,固定化细胞培养
基本操作和过程:
1、愈伤组织培养基的配制。
①配制液体培养基配制含有各种所需营养成分的液体培养基,其浓度是所需培养基浓度的2倍。
②琼脂的配制与熔化按照1.5%琼脂的比例称取琼脂,加入所需培养基体积一半的蒸馏水,放置一段时间,待琼脂吸水膨胀后加热使琼脂完全熔化。
③分装将上述熔化的琼脂趁热与液体培养基按照1:
1的比例混合均匀,用稀酸或稀碱调节至所需的pH值,分装于培养皿、三角瓶或试管等培养容器中。
④灭菌在120℃的条件下,灭菌15~20min,冷却后备用。
2、愈伤组织的选择。
通常在愈伤组织诱导的10-15d左右进行继代培养,在继代培养的第10-15d进行新一轮的继代培养。
3、接种。
首先在无菌条件下,用镊子或小刀将选择好的愈伤组织块分割成若干小块,剔除附着在愈伤组织块上的原有培养基,必要时可以用无菌水清洗几次,然后在无菌条件下将处理好的愈伤组织小块转移到含有新鲜固体培养基的培养皿中。
4、培养。
将培养皿置于培养箱中,在一定条件下进行培养。
培养一定时间后,适时地进行下一轮的继代培养或接种到液体培养基中进行细胞悬浮培养。
例:
从愈伤组织获得植物细胞有哪两种操作方式?
将愈伤组织接种到新鲜的固体培养基中是怎样操作的?
(10分)
答:
方法1:
对诱导获得的愈伤组织用镊子或小刀分割得到植物小细胞团;
方法2:
将愈伤组织转移到液体培养基中,加入经过杀菌处理的玻璃珠进行振荡培养,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞,然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤,除去大细胞团和残渣,得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。
操作:
在无菌条件下,首先用镊子或小刀将选择好的愈伤组织块分割成若干小块,将原培养基清洗干净,然后将处理好的愈伤组织小块转移到含有新鲜固体培养基的培养器皿中。
三、植物细胞培养中提高植物次生代谢物生产的途径。
(具例见教材)
1、添加诱导因子:
引起植物过敏反应,诱导植物特定基因表达,进而激活特定次生代谢途径,积累特定的目的次生代谢物,具有种属专一性;
2、前体饲喂:
在植物细胞培养中加入次生代谢物合成的前体物质;
3、两相法培养:
细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物,而这些产物又通过主动或被动运输方式释放到细胞外,并被另一相所吸收,达到富集产物的目的;
4、培养条件的控制:
通过优化培养基、光照、温度、通气等条件的调控,使细胞次级产物分泌变多;
5、在培养基中添加代谢产物合成抑制剂;
6、其他,如选育高产细胞株,二步法培养,新型生物反应器等。
四、植物细胞培养次级代谢物生产的基本工艺过程,过程涉及到哪些研究内容?
如何进行研究?
工艺过程:
1、外植体的选择与处理;2、植物细胞的获得;3、植物细胞的扩大培养;4、植物细胞悬浮培养;5、次级代谢物的分离纯化
研究的内容:
1、外植体的选择和处理研究;2、愈伤组织诱导;3、植物细胞的诱变、筛选;4、细胞悬浮培养的研究;5、提取分离与纯化方法研究
五、植物细胞培养生物转化制药的基本工艺过程,过程涉及到哪些研究内容?
如何进行研究?
生物转化基本过程:
1.转化反应植物细胞筛选2.外植体的选择和处理3.培养基的选择和配置4.细胞的获取5.稳定细胞系的建立6.加入底物进行生物转化7.转化产物的提取分离8.产物检测
研究内容:
1.转化持续时间的研究2.底物浓度的研究3.不同细胞密度的研究4.培养体系pH值的研究5.温度光照的研究
六、植物细胞培养代谢物生产制药和生物转化制药其过程的影响因素。
植物细胞培养代谢物影响因素:
1.外植体的选择。
不同外植体的悬浮细胞培养物,其最大次级代谢产物的累计时间各异。
2.培养条件的影响
培养环境的内在因素:
a。
接种和诱导
b。
基本培养基的组成:
1.磷2.氮3.碳源4.植物生长调节剂5.O2和pH值6.渗出物
两步培养法
培养环境的外部因素:
温度2.搅拌频率3.培养容器的影响4.光的影响
生物转化制药其过程的影响:
1、植物细胞的影响1.转化系统的影响2.细胞系的影响3.细胞生长阶段的影响
2、外源底物的影响
(1)外源底物浓度的影响:
外源底物对培养的植物细胞一般都是有毒性的
(2)外源底物结构的影响
(3)外源底物添加方式的影响不溶性的底物,先溶解后再加入;活用细粉末;用吐温或环糊精来促溶
3、培养条件的影响
培养基的组成、植物激素、刺激剂、抑制剂以及pH值、温度、光照等培养条件。
第六章动物细胞培养制药
一、动物细胞的生理特点,生产用动物细胞的种类及其特点,生产用动物细胞的获得,工程细胞库的种类及要求,细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领。
生理特点:
1、动物细胞的分裂周期长;2、细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象;3、正常二倍体细胞的生长寿命有限;4、对环境敏感;5、对培养基要求高;6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。
细胞种类及特点:
1、原代细胞:
增殖能力有限,需大量动物。
2、二倍体细胞体:
2n型染色体组,传代寿命有限,具有明显的贴壁依赖和接触抑制特点,无致癌性。
3、转化细胞系:
具有无限繁殖超额能力,倍增时间较短,对培养条件和生长因子要求较低。
4、融合细胞系:
杂交特性。
5、重组工程细胞系
工程细胞库的种类及要求:
1、原始细胞库(MCB):
储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质细胞,对二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。
储存时需有该细胞的详细档案,包括该细胞系的历史,和对各种有害因子的检查结果。
2、生产用细胞(MWCB)储存于MWCB的细胞应该是从MCB来的,或从单一安瓿来,或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的然后经培养扩增达一定数量后,再分装储存形成的细胞库。
该细胞库同样需要建档案,而且需进行无菌性的无细胞交叉污染的检查。
细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领:
常用技术是液氮冷冻保存法,主要采用加入适量保护剂的缓慢冷冻法保存细胞。
步骤:
细胞悬液制备→加保护剂→分装和封口→液氮冻存。
复苏一般采用快速融化法,以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。
二、动物细胞体外培养的生长与增殖过程,动物细胞与微生物细胞和植物细胞在培养上的区别,动物细胞培养的方法和操作方式及其特点。
生长与增殖过程:
原代培养期→传代培养期→衰退期。
培养区别:
1、动物细胞无细胞壁,且大多哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长;2、对营养要求严格,除氨基酸,维生素,盐类,葡萄糖或半乳糖外,还需要血清;3、动物细胞对环境敏感,包括pH,溶氧,温度,剪切应力都比微生物有更严的要求,一般需严格地监测和控制。
培养方法及特点:
1、悬浮培养:
适用于一切各类的悬浮细胞和兼性贴壁细胞。
优点:
操作简便,培养条件较均一,传质和传氧较好,容易扩大规模培养。
缺点:
较难采用灌流培养,细胞密度一般较低(即不适于高密度培养)。
2、贴壁培养:
适用于一切贴壁细胞和兼性贴壁细胞。
优点:
适用的细胞各类广,较易采用灌流培养,细胞密度高,缺点:
操作比较麻烦,需要合适的贴附材料和足够的面积,培养条件不均一,传质和传氧较差。
3、贴壁-悬浮培养:
将悬浮培养和贴壁培养两者结合,优势互补,主要方法有:
微载体培养,包埋和微囊培养,结团培养。
操作方法及特点:
1、分批式操作:
细胞和培养基一次性加入反应器进行培养。
2、流加式操作:
不断加入营养成分而不取出条件培养基(经培养已经含有细胞产物但不含细胞的培养基)。
3、半连续式操作:
细胞和培养基加入反应器后,在细胞增长和产物形成过程中每隔一段时间取出部分培养物,补充同样数量新鲜培养基,反应器内培养液的总体积保持不变。
4、连续式操作:
连续地加入新鲜培养基,同时等速地取出反应器内的培养液(连同细胞)。
5、灌流式操作:
不断取出部分条件培养基(无细胞),补充等量新鲜培养基。
三、动物细胞大规模培养的主要影响因素及其不良因素的控制。
主要影响因素:
1.细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压)2.乳酸和氨的毒性累积3.必需营养物的添加4.对细胞的剪切作用
不良因素解决手段:
设计适应细胞生长的无血清培养基;控制营养物的添加;减少产物消耗积累;剪切损害可通过反应器的优化被减少,另外在培养液中添加剪切抑制剂。
四、动物细胞培养制药的基本工艺过程。
目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白工业化过程的主要通用技术平台及其特点。
如何进行动物细胞培养制药的研究。
动物细胞-(捣碎)-组织碎片-(酶处理)-单个细胞-离心收集细胞-(营养培养)-培养瓶培养-(酶)消化处理-接种-扩大培养-种子细胞液氮保存-取出细胞种子-种子解冻复活培养-扩大培养-接种-大规模培养-产物分离纯化-产品。
技术平台及特点:
主要是以搅拌式生物反应器悬浮培养(70%以上)作为通用技术平台,平台工艺的特点是采用无血清培养(50%以上)和成熟的流加和灌流工艺。
悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压),终产物(乳酸和氨)毒性累积和必需营养物的添加等。
设计适应细胞生长的无血清培养基,控制营养物的添加,减少产物消耗积累是解决问题的有效手段。
对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被减少,另外在培养液中添加剪切保护剂。
贴壁细胞生产工艺,最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培养系统,并可提供最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。
最佳的工艺设计是高密度连续灌流培养。
流加培养和灌流培养是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式。
五、为什么要研究不同宿主菌对目的蛋白表达的影响?
是怎样进行研究的?
由于不同载体提供的不同增强子和启动子都有自己特异的结合蛋白,而只有能为它们提供这些蛋白的宿主菌才能使目的基因得到更好的表达。
此外,不同大肠杆菌的不同种和亚种所含有的宿主蛋白酶种类和数量不同,对表达的产物会有不同程度的降解作用。
故宿主菌的选择是不可忽视的