平均发芽期（MET）根据Ellis和Roberts（1981）的方程计算：
公式中，D为从种子萌发开始累计的天数，n是开始萌发后第D天萌发的种子数。
出苗活力（EE）取决于播种后的第四天（Farooqetal.2006b），出苗均匀性系数（CUE）根据Bewley和Black（1985）的公式计算：
其中，t为天数，以播种日t=0开始计数；n为至t天累计萌发的种子数;
和MET的值相等。
15天的发芽后，在最适和胁迫条件下，分别取样本（主分蘖的上二叶）进行生化分析。
然后，将幼苗小心地从沙中取出，进行幼苗活力测定。
记录每组重复幼苗次生根和叶片数量，测量叶片、芽、初生根的长度，每个重复取10株苗，计算平均数。
幼苗次生根数量和叶片数目可分别作为根和叶的评价数据。
幼苗鲜重在取苗后立即测定，幼苗干重则在70℃条件下干燥7天后测量。
相对含水量：
用水将新鲜叶片（0.5g;Wf）冲洗清洁至其重量不再改变。
将此含水饱和叶片称重（WS），然后在80℃下干燥24h，称重（Wd）。
根据以下公式（Barr和Weatherley,1962）计算其RWC：
膜电解质渗漏量：
膜电解质渗漏量的测定参照Blum和Ebercon（1981）的方法。
取6份叶片样本，用蒸馏水洗净，在6ml的蒸馏水中浸泡12h。
用电导率仪（型号DDS-11A;中国上海Leici仪器公司）测定溶液的电导率，计为C1；将样本放入沸水中加热20min，冷却至室温，测得死亡组织的电导率，计为C2。
C1和C2的比值即为膜电解质渗漏量。
淀粉代谢：
可溶性糖总量和α淀粉酶活性是评价淀粉代谢的指标。
测定可溶性糖总量的方法是将1g碎叶样品与10ml蒸馏水混合置于25℃下24h（Lee和Kim2000），过滤（用No.42滤纸），最后加蒸馏水定容至10ml，用苯酚-硫酸法测定可溶性糖总量（Duboisetal.1956）。
测定α淀粉酶活性的方法是将1g碎叶样品与10ml磷酸盐缓冲剂（pH7.0）混合置于4℃下24h。
酶的活性取决于di-nitrosa-licyclicacid（DNS）法（Bernfeld1955）测定时的上层清液。
一个酶活性单位是指1min内分解1μlmol麦芽糖（1ml原酶1min分解）的酶量。
抗氧化活性物质的提取和检测：
超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照McCord和Fridovitch（1969）的方法。
将0—50μlmol提取液加入到含有50mMHEPES/KOH缓冲液（pH7.8）、0.05U黄嘌呤氧化酶、0.5mM氮蓝四唑和4mM黄嘌呤物质的反应混合液中，可测SOD对光化还原反应（560nm波长下）的抑制作用。
一个单位的SOD活性等价于抑制50%光反应所需的酶的体积。
过氧化氢酶（CAT）的活性的测定参照改良后的Luck（1974）法。
提取50μl酶添加到3ml过氧化氢磷酸盐缓冲液中（pH7.0），吸光度从0.45降低至0.40所需的时间需要注意。
以含磷酸氢盐（不含过氧化物）缓冲液的酶解液作为对照组。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定参照Nakano和Asada（1987）的方法，并进行了细微的改良。
将50mMHEPES/KOH缓冲液（pH7.6）、0.1mMEDTA、0.05mM抗坏血酸盐、10μl抗坏血酸盐和0.1mMH2O2配制成反应混合液，在265nm波长条件下，此混合液中的抗坏血酸盐被氧化成脱氢抗坏血酸。
统计分析：
本实验进行了两次；汇集的数据用cosTAT计算机软件进行了统计分析。
用最显著差异测试比较试验中不同处理方式对试验结果的影响。
用MicrosoftExcel程序进行数据的图形演示，并进行标准误差计算来比较不同的处理方式，以比较其抗氧化物和膜电解液泄漏量及RWC的不同。
试验结果：
与最适温度条件下相比，寒冷胁迫大大延长了发芽期,使同步出苗率降低，最终出苗数量减少；而用GB处理过的种子，无论在最适温度还是在寒冷胁迫条件下，发芽期均提前，出苗一致性提高（图1—3）。
在正常和胁迫条件下，与其他处理浓度相比，100mglˉ1GB浓度的处理对缩短50%幼苗出土的时间（E50）和MET的效果最显著，同时最大程度的提高了出苗活力、最终出苗率和CUE（图1—3）。
所有经处理的种子在最适温度和寒冷胁迫条件下的出苗率均有所提高，但150mglˉ1GB浓度处理下的CUE和未经处理的对照组的值相近（图.3）。
寒冷胁迫使幼苗的根芽长度缩短，苗鲜重和干重降低，根叶数量减少（图4—6）。
除150mglˉ1GB浓度处理后未提高叶片数量外，其他浓度GB处理后均使以上各项测量指标有所提高。
与对照相比，在最适温度和寒冷胁迫条件下，100mglˉ1GB浓度的处理使根芽长度（图.4）、苗鲜重和干重（图.5）、叶片数量（图.6）达到最大，但是根的数量达到最大则由50mglˉ1GB浓度处理得来（图.6b）。
寒冷胁迫使幼苗相对含水量（RWC）降低，膜电解质渗漏量增加（图.7）。
在胁迫条件下，经GB处理后幼苗的RWC均有所提高，而在正常温度条件下GB处理则不能提高幼苗的RWC（图.7a）。
在正常和胁迫条件下，经GB处理后玉米叶片的膜电解质渗漏量均有所降低，两种条件下的最小渗漏量在50mglˉ1GB浓度处理下得出（图.7b）。
低温胁迫使淀粉酶活性降低（图.8a），可溶性糖量减少（图.8）。
与对照相比，两种温度条件下，经GB处理后幼苗的淀粉酶活性和可溶性糖量均有所提高（图.8a）。
两种条件下的最大淀粉酶活性和可溶性糖量在50mglˉ1GB浓度处理下得出（图.8）。
与对照相比，最适和低温下，经GB处理后幼苗的SOD活性（图.9a）、CAT（图.9b）、APX（图.10）均有所提高。
两种条件下的最大SOD活性、CAT和APX活性在50mglˉ1GB浓度处理下得出（图.8—10）。
在正常和胁迫条件下，通过比较分析抗氧化物和RWC可以得出RWC和SOD、RWC和APX均呈较强的正相关。
然而，只有在寒冷胁迫条件下，RWC和CAT才呈正相关（表1），最适温度下不可得出此关系。
在正常和胁迫条件下，分析数据可得出抗氧化物和膜电解质渗漏量呈较强的负相关。
甜菜碱处理播前种子
图.1在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其50%出苗期（a）和平均出苗期（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.2在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其发芽活力（a）和最终发芽率（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.3在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其出苗均匀性系数的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.4在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其苗高（a）和根长（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.5在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其幼苗鲜重（a）和干重（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.6在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其叶片数（a）和根数（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.7在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其相对含水量（RWC）（a）和膜电解质渗漏量（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.8在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其α淀粉酶活性（a）和可溶性糖含量（b）的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.9在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其超氧化物歧化酶（SOD）（a）和过氧化氢酶（CAT）（b）活性的影响。
甜菜碱处理播前种子
图.10在最适及低温条件下，甜菜碱处理播前玉米种对其抗坏血酸过氧化物酶（APX）的影响。
表1在正常及冷害胁迫条件下，不同抗氧化物与膜电解质渗漏量、叶片相对含水量的相关系数（r）如下：
讨论：
本研究证明了用GB处理杂交玉米种可显著提高其耐寒性。
即使在寒冷胁迫条件下玉米出苗、早期幼苗生长和代谢受到扰乱，GB处理后的玉米种在最适和胁迫条件下的各项表现均有所提高。
实验证明，在正常和胁迫条件下，100p.p.m.浓度的处理对提高杂交玉米的出苗率、促进幼苗早期生长、提高抗氧化剂活性和促进机体新陈代谢效果最显著。
与对照相比，150p.p.m.浓度的处理并不能提高幼苗的根数（图.6b）；GB处理玉米种不仅显著地提高了种子的发芽率、加快了种子萌发的速度，还提高了幼苗活力，使其根芽长度、苗鲜重和干重、叶片数均有所增加。
寒冷胁迫下的膜电解质渗漏量大大增加，而GB处理可使膜电解质渗漏量显著降低。
增大的膜电解质渗漏量被认为是胁迫诱导导致膜损伤和解体恶化的症状表现（Fengetal.2003）。
在低温胁迫条件下，RWC也会显著下降。
由于低温诱导产生水分胁迫，受到冷害的玉米植株通常会表现出水分胁迫的症状（Melkonianetal.2004）。
低温诱导的水分胁迫以降低根系液压电导率开始，随后叶片水分状况明显变差（Fennell和Markhart1998,Arocaetal.2001）。
若根和芽都处于低温下，尽管叶水分状况不良，气孔也不能被关闭。
除了根系液压电导率下降的原因，气孔调节失控也会进一步加剧低温诱导产生的水分胁迫（Pardossietal.1992;Leeetal.1993），这时的叶片RWC降低至致死水平（Pardossietal.1992,Leeetal.1993）。
然而,GB处理后，渗透调节或细胞壁弹性的改变或者二者共同的作用改善了组织的水分状况（Bandurska和Stroiski2007,Korkmazetal.2007），这证明了抗氧化物和RWC之间有很强的相关性（表1）。
包括拟南芥在内的多种植物（Xing和Rajashekar2001）依靠机体建立GB调节系统来产生抗寒性，如玉米（Chenetal.2000,Quanetal.2004a,b）、番茄（Parketal.2006）、鹰嘴豆（Nayyaretal.2005）和小麦（Nayyar和Kaushal2002）。
能够产生更多GB的转基因植物能表现出更强的耐寒性（Quanetal.2004a,b）。
这都充分证明GB参与了机体防御反应。
另外,外源GB的应用也提高了机体的耐寒性，这主要是由于其直接保护大分子和细胞膜，诱导抗氧化剂发挥作用（Parketal.2006）。
在耐胁迫方面，GB能在一定程度上保护转录和翻译机制、充当复性酶的辅助分子（Rhodes和Hanson1993）、增强细胞呼吸作用、提高RWC、增加叶绿素和蔗糖含量、使活性氧ROS产生量下降（Nayyaretal.2005）。
例如，在胁迫条件下，转基因玉米比野生型玉米累积了更多GB，细胞膜的完整性得到了更好的保护，酶的活性也大大提高（Quanetal.2004a,b）。
植株在某些环境胁迫下通常会产生ROS（Munne-Bosch和Penuelas2003）。
ROS会与蛋白质、脂类、DNA发生相互作用，导致氧化损伤,损害正常细胞的功能（Foyer和Fletcher2001）。
冷害胁迫条件下，许多植物中抗氧化剂的表达量均增加（He′rouartetal.1991）。
抗氧化剂、脂溶性或水溶性净化分子能够清除植株中的ROS（Foyeretal.1994）；抗氧化酶对防止氧化损伤的作用最为有效（Halliwell和Gutteridge1999）。
目前的结果证明，低温胁迫条件下玉米幼苗的酶抗氧化活性要高于其种植于正常温度下的水平。
这表明玉米杂交种Hycorn8288在胁迫条件下有激活机体自身抗氧化系统的能力。
Fryer等人（1998）也证实了在寒冷胁迫条件下酶类和非酶类抗氧化物质会有所增加。
GB处理后，两种生长条件下玉米的SOD、CAT和APX活性均显著提高。
在低温胁迫下，叶片中较高的CAT活性意味着机体有一套更有效的净化系统，它可以更好地保护机体抵抗ROS的伤害。
相较于本研究，Feierabend等人（1992）的报告中提到低温强光条件下，CAT的补体光灭活作用会使植物的CAT活性降低。
然而，Prasad（1996,1997）的结论提出低温会提高CAT的活性，这个结论与我们的结果相符。
膜电解质渗漏和抗氧化剂呈负相关（表1），抗氧化剂产生量的增加会使植株系统中基于ROS产生的一系列损伤减少。
总之，用GB处理杂交玉米种子可以提高其耐寒性。
GB处理的杂交玉米种在正常温度条件下各项指标表现也有所提高。
在低温和正常两种条件下，100mglˉ1均为最佳处理浓度。
植株组织高含水量的维持、膜电解质渗漏量的降低和较高的抗氧化剂活性则成为衡量GB诱导耐寒性的合理指标。
参考文献：
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