neon细胞电转仪中文说明书.docx

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neon细胞电转仪中文说明书

Neon细胞电转仪中文说明书（MPK5000）（总12页）

一，简单的3步骤程序。

1.将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。

2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中;在设备上选择程序，然后按开始。

3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。

注：

1.为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。

建议在切换到不同质粒DNA/siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液

2.为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次

二，软件操作程序

1.按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon设备。

本机检查确保Neon移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。

2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。

按所需的电压值，然后按Done保存该值。

注意：

如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。

3.按Width激活数字键盘输入宽度值。

按所需的宽度值，然后按Done保存该值。

4.按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。

按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。

5.如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。

6.按所需的程序号码编辑程序。

选定的程序会突出显示。

7.显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。

光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。

继续输入Voltage，Width和Pulses信息。

8。

按Enter键将信息保存在数据库中。

9.继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座

三，细胞与DNA混合物准备

注意事项：

1.将纯化的DNA重悬于1-5μg/μL浓度的去离子水或TE缓冲液（10mMTrisHCl，1mMEDTA，）中。

浓度可能因细胞类型而异。

2.DNA量不应超过使用总体积的10％。

3.通过测量A260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。

电穿孔的比例应至少为。

4.该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。

使用大于20kb的质粒很可能降低转染效率。

5.不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。

通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。

6.不含Ca2+和Mg2+的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）

流程：

1.用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon?

Tip和BufferE2，100μLNeon?

Tip）填充电转杯。

（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。

）

2.将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。

确保Neon管的侧面电极与Neon移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）

3.在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％汇合。

4.对于大多数优化协议，每10μLNeon?

Tip可提供5×104-2×105个细胞。

（5×105-2×106个细胞每100μLNeon?

Tip适用于大多数优化的方案。

）

5.将含有血清，PBS（不含Ca2+和Mg2+）和胰蛋白酶/EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37℃。

从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2+和Mg2+）冲洗细胞。

使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLEExpress（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。

取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。

将细胞转移到微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400×g离心细胞5分钟。

通过在室温下以100-400×g离心5分钟，用PBS（不含Ca2+和Mg2+）清洗细胞。

吸出PBS并以×107个细胞/mL的最终密度将细胞沉淀重悬于ResuspensionBufferR中。

轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。

避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。

可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。

6.通过用含有血清和补充剂的培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预培养板。

如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。

7.对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。

使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液

8.使用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon?

Tip和缓冲液E2，100μLNeonTip）装入Neon移液管

9.根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件

10.将适量的质粒DNA/siRNA转移到无菌的微量离心管中。

11.将细胞加入到含有质粒DNA/siRNA的管中，轻轻混合。

请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。

12.要将NeonTip插入Neon移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具

13.将Neon移液器的顶部插入NeonTip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）

14.轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。

注意：

确保Neon?

移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接

15.将Neon移液器上的按钮按到第一站，并将NeonTip浸入细胞DNA/siRNA混合物中。

缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA/siRNA混合物吸入NeonTip。

在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。

如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。

16.将带有样品的Neon移液器垂直插入放置在Neon移液器站中的NeonTube，直至听到咔嗒声。

确保移液器突起插入吸液管的槽中。

17.确保Neon移液器的金属头与Neon移液器支架内的球形活塞和NeonTube（见左图所示的正确位置）紧密连接。

18.在传送电脉冲之前，Neon设备会自动检查NeonTube和NeonPipette是否正确插入。

19.在电穿孔期间监测Neon?

Tip，以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧（火花）。

电弧导致转染效率低，细胞活力低。

20.交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete”以指示电穿孔完成。

21.从Neon移液器站慢慢移除Neon移液器，并立即从NeonTip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养基中。

22.我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。

23.要放弃Neon?

Tip，请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。

24.对剩余的样品重复步骤7-16。

使用两次后，请务必更换NeonTips，并在10次使用后更换NeonTubes。

每个新的质粒DNA样品使用新的NeonTip和NeonTube

25.轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。

在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。

注意

1.如果您没有使用Neon?

设备，将后面的电源开关转到OFF位置。

2.避免在Neon?

移液器台内溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。

3.如果您不小心将任何液体（如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon?

移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。

倒置并允许车站在室温下完全干燥24小时。

优化流程

1.确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA，并制备含有mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。

准备足够的细胞和质粒DNA/siRNA进行至少30次转染。

2.对于使用24孔格式的10μLNeon?

Tip的每个电穿孔样品，请参见下表。

对于以24孔格式使用100μLNeon?

Tip，请将下表中列出的数值适当调整10倍。

3.使用3mL电解缓冲液（将缓冲液E用于10μLNeon?

Tip和缓冲液E2，100μLNeonTip）置于含有细胞DNA/siRNA混合物的Neon移液站中，如第15页所述。

4.按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。

5.电穿孔后，立即取出Neon?

移液器，将样品从10μLNeon?

Tip中转移到预热的mL培养基中。

6.对于100μLNeon?

Tip，将稀释样品在900μL培养基中稀释10倍，并将100μL样品转移至mL预热培养基中。

7.对剩余的样品重复步骤3-5。

8.轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。

在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。