转录因子Sp1对成肌细胞中猪SKIP的表达调控作用.docx
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转录因子Sp1对成肌细胞中猪SKIP的表达调控作用
转录因子Sp1对成肌细胞中猪SKIP的表达调控作用
摘要:
利用基因组pcr步移方法获得猪skip转录起始位点上游2075bp启动子序列。
生物信息学分析发现该序列中存在4个sp1结合位点和1个cpg岛。
将启动子序列构建到pgl3-basic的双荧光素酶报告基因载体上,再利用rna干扰技术分析转录因子sp1对skip转录的影响。
荧光素酶活性分析发现sp1的表达抑制使成肌细胞中skip启动子活性显著下降,表明转录因子sp1可能通过顺式作用元件gc-box对成肌细胞分化过程中skip基因的转录激活起正向调控作用。
关键词:
sp1;猪;skip;启动子活性;rna干扰
abstract:
genomewalkingtechniquewasusedtoclonetheproximalpromoterregionofporcineskip.afragmentof2075bpupstreamstartcodewasobtainedfromgenomicdnaofporcine.bioinformaticsanalysisrevealedthatithad4sp1bindingsitesandonecpgisland.theclonedskippromoterwereclonedintotheupstreamofpgl3-basictoanalyzetheeffectofsp1onskiptranscriptionactivitybyrnaitechnique.luciferaseactivityanalysisindicatedadecreaseinskiptranscriptionalactivitythroughinhibitingtheexpressionoftranscriptionfactorsp1indifferentiatingc2c12myoblasts.theseresultssuggestedthatthetranscriptionfactorsp1playedapositiveregulatoryroleinskipexpressionpossiblybygcelementsinmyotubes.
keywords:
sp1;porcine;skip;promoteractivity;rnaiinterference
骨骼肌纤维是骨骼肌的主要组成部分,肌纤维的数量和大小直接影响家畜的胴体性状,与遗传因素相关。
5′肌醇磷酸酶(skip)由ijuin等[1]首先发现并分离,在各组织中广泛表达,尤其在心脏、骨骼肌和肾脏中高表达,因此skip被称为骨骼肌和肾脏富含的5′肌醇磷酸酶。
通过人与猪比较图谱,发现猪的skip定位在猪12号染色体ssc12q1.3上。
其所在位置存在影响第10肋骨背膘厚、胴体长[2]、肌纤维数量[3]和大腿重[4]的qtl区域。
运用牛基因图谱信息,发现牛skip定位在19号染色体bta19q1.3上,其所在位置存在影响犊牛出生重[5]的qtl区域。
skip杂合突变小鼠比目鱼肌和股四头肌的重量显著提高[6]也印证skip具有调节骨骼肌纤维发育的功能。
因此有必要进一步研究该基因参与骨骼肌生长发育的表达调控机制,为弄清楚肌纤维的生长发育规律奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
限制性内切酶、t4连接酶、反转录试剂盒等购自fermentas-mbi公司;taqdna聚合酶、sybrgreenreal-timepcrmastermix、dntp、dna分子质量标准dl2000、pgl3-basic载体等购自全式金生物公司;染色体步移试剂盒购自clotech公司;双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自promega公司。
1.2步移引物设计和pcr扩增
根据猪skip第一外显子序列,采用primer5.0设计步移巢式引物,如表1,引物由北京奥科生物技术有限公司合成。
步移扩增由两轮pcr反应组成。
第一轮pcr反应体积为50μl,反应体系为5μl10×buffer,1μldntp(10mmol/l),1μl引物ap1和第一轮pcr特异引物,1μl文库dna模版,去离子水补足至50μl,离心混匀。
第一轮pcr反应条件为:
94℃5min后迅速加入taq酶1μl;94℃25s,72℃3min,7个循环;然后94℃25s,67℃3min,32个循环;67℃7min。
取5μl第一轮pcr产物,在1.5%的琼脂糖中电泳检测。
确认后继续第二轮pcr反应。
除了模板、引物改变外,第二轮pcr反应体系与第一轮相同。
将1μl第一轮pcr产物(包括阳性和阴性对照)稀释50倍,取其中1μl作为第二轮pcr反应的模板,引物为ap2和第二轮pcr特异引物。
第二轮pcr反应条件为:
94℃预变性10min;94℃变性25s,72℃3min,5个循环;94℃变性25s,62℃3min,20个循环;67℃延伸7min。
取5μl产物,在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳。
1.3生物信息学分析
在线网站http:
//www.cbrc.jp/research/db/tfsearch.html分析基因启动子区的转录因子结合元件,methprimer(http:
//www.urogene.org/methprimer/index1.html)预测基因启动子区是否有cpg岛。
1.4猪skip启动子表达载体的构建
根据pgl3-basic载体的多克隆位点和猪skip的启动子序列,设计包含sacⅰ酶切位点的正向引物p1f:
5′-aaagagctcactcttgttgatgtggctt
ga-3′和xhoⅰ酶切位点的反向引物pr:
5′-ccctc
gagctgcttctcggttcggtct-3′,以猪基因组dna为模板进行pcr扩增。
直接将符合目的片段大小的pcr产物用限制性内切酶sacⅰ和xhoⅰ双酶切,37℃过夜。
将sacⅰ和xhoⅰ双酶切的线性化pgl3-basic载体与目的片段按照1∶3摩尔比均匀混合,用t4连接酶连接,然后转化大肠杆菌dh5α。
1.5化学合成sp1-sirnas
根据在线软件https:
//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do设计化学合成的sirna靶序列,见表2。
1.5实时定量pcr
在sp1-sirnas转染c2c12细胞6h后用2%马血清诱导细胞分化,于分化第三天提取细胞rna。
pcr反应体系:
sybrgreenreal-timepcrmastermix12.5μl,定量引物0.5μmol/l,cdna模板500ng,补去离子水至总体积为25μl。
pcr扩增程序:
95℃预变性2min;94℃变性20s,58℃退火20s,72℃延伸35s,74℃读板,40个循环,每个样3个重复。
pcr反应的特异性通过产物溶解曲线确认。
用biorad公司的iq5软件分析结果。
先将阈值选定在各对数扩增曲线平行上升的最低点,得到各管的ct值。
软件会算出每个基因ct值的平均数及标准差和每组特异基因相对于内参的表达量。
应用spss13.0软件的单因素方差方法分析不同处理组中基因的表达是否具有显著差异,p<0.05为具有显著性差异。
1.6启动子的荧光素酶活性分析
在重组载体和sp1-sirna共转染c2c12细胞24h后,小心吸弃培养基,pbs洗2次。
200μl/孔的passivelysisbuffer滴加到24孔板的每孔细胞中,在室温避光裂解15min。
置振荡器振荡30s,将裂解完全的细胞裂解液收集到1.5mlep管中,-80℃贮存备用。
检测前先在室温中平衡细胞裂解混合液,每个样品取10μl到黑色96孔酶标板中摇匀,使细胞裂解液均匀铺满底部。
提前30min预热报告基因检测仪。
将样品、工作液依次放入到检测仪器内,设置好程序后开始检测,每个样品将会有2个荧光素酶报告值a和b,a值与b值的比值就是每个样品的相对表达量。
2结果与分析
2.1猪skip启动子的克隆
根据猪skip第一外显子序列,设计2条特异的pcr引物,分别为fgps1和fgps2。
以4个不同酶切的基因组步移库为模板,以fgps1和ap1(adaptorprimer1)配对进行第一轮pcr反应。
将第一轮pcr反应产物用去离子水稀释50倍后作为第二轮pcr反应的模板,将引物fgps2与ap2(nestedadaptorprimer2)组合进行第二轮pcr扩增。
扩增结果电泳检测,第一轮pcr反应的产物均呈弥散带(图1-a);第二轮pcr产物中,经pvuⅱ消化后的基因组为模板扩增出大小约328bp的片段,电泳检测结果如图1-b所示。
根据第一次pcr步移得到skip启动子序列,设计了另一对嵌套特异引物sgps1和sgps2对skip进行第二次步移。
同样以4个不同酶切的基因组步移库为模板,引物sgps1与ap1组合进行第一轮pcr扩增(图2-a),以sgps2和ap2为巢式引物进行第二轮pcr扩增(图2-b)。
在第二轮pcr产物中,经draⅰ消化后的基因组为模板扩增出大小约871bp的片段(泳道4)。
鉴于扩增片段长度偏短,再根据第二次pcr步移得到skip启动子序列,又设计了一对嵌套特异引物tgps1和tgps2对skip进行第三次步移。
继续以四个不同酶切的基因组步移库为模板,引物tgps1与ap1组合进行第一轮pcr扩增(图3-a),以tgps2和ap2为巢式引物进行第二轮pcr扩增(图3-b)。
在第二轮pcr产物中,经ecorv消化后的基因组为模板扩增出约1182bp的片段(泳道4)。
将3次基因组步移所得到的序列拼接起来,得到猪skip部分启动子序列。
2.2启动子序列分析
将3次基因组步移拼接得到的猪skip启动子区序列利用在线软件tfsearch预测分析启动子中的潜在顺式作用元件,发现3个潜在的tatabox,2个myod结合位点,4个sp1结合位点和1个位于起始密码子上游的cpg岛,如图4所示,而4个sp1结合位点都处于cpg岛中。
为了阐明skip的表达调控机制,将2075bp的启动子序列片段(-2038到+37)克隆到pgl3载体中命名为p1,酶切鉴定如图5。
2.3sp1-sirna的合成和干扰效果
为了深入了解sp1对肌细胞分化过程中skip转录的影响,用化学合成的方法合成sp1的干扰序列sp1-sirnas,化学合成的sp1-sirnas转染分化中的肌细胞的实时定量分析如图6所示。
实时定量pcr结果显示,sp1和β-actin标准曲线制备均在线性范围内,扩增产物溶解曲线符合要求。
sp1的mrna表达量在各试验组及对照组中整体水平差异显著(p<0.05)。
3个sp1-sirna在肌细胞中均抑制sp1的表达,其中sp1-sirna2抑制率最高。
2.4sp2-sirna2表达抑制对肌细胞分化和skip启动子活性的影响
由图7可知,sp2-sirna2显著降低了mhc和tnt的表达,抑制了肌细胞的终末分化。
利用sp1-sirna2与启动子p1共转染肌细胞分析sp1对肌细胞中skip表达的影响。
荧光素酶活性分析表明sp1受到干扰时,skip启动子的活性也显著下降了(图8)。
表明转录因子sp1可能通过顺式作用元件gc-box对肌肉细胞分化过程中skip的转录激活起正向调控作用。
3讨论
有研究发现,脊椎动物基因组包含未甲基化的cpg岛[7]。
虽然不清楚这些区域是怎么维持非甲基化状态的,但是在有些情况下这依赖于转录因子sp1的结合[8]。
sp1是较早克隆和鉴定出的结合在sv40启动子上的真核转录因子[9]。
它包含3个锌指结构基序,cys-2-his-2,能结合在ggggcgggg序列上[10]。
sp1结合位点经常在cpg岛区出现。
有研究发现sp1结合位点对维持aprt基因cpg岛的非甲基化状态十分关键[11]。
预测发现位于转录起始位点上游的1个cpg岛区域和若干sp1结合位点,推测sp1转录因子可能是调节skip稳定表达的潜在转录因子。
如果没有sp1结合位点遍布cpg岛区,则skip启动子很容易被甲基化引起转录活性的抑制,但是5′肌醇磷酸酶skip是广泛表达且在某些组织是高表达的,暗示转录因子sp1可能避免基因组cpg岛被甲基化。
通过sp1rna干扰分析p1启动子在肌细胞的活性,发现skip的启动子活性确实受细胞内sp1表达水平的调节,sp1转录因子的表达抑制显著地降低了skip的活性,可见反式作用因子sp1对skip的稳定表达至关重要。
sp1以丰富的核蛋白形式存在于大多数细胞中,但是在不同的发育阶段和不同类型的细胞中,表达水平是有差异的[12]。
sp1对myod转录因子家族的转录活性和肌肉细胞的分化也有影响,有研究发现prb、mdm2和sp1协同调节肌肉细胞的分化[13,14]。
sp1的转录活性受到与mdm2蛋白互作的影响,sp1与mdm2的结合抑制了sp1与肌肉特异表达基因启动子dna序列的结合,而当sp1与mdm2的结合受到prb竞争抑制时,sp1从sp1-mdm2蛋白复合体中释放出来,重新结合顺式作用元件与myod转录因子家族成员共同激活肌肉特异表达基因的转录,促进肌肉细胞的分化。
研究发现干扰sp1的表达影响肌细胞的终末分化,进一步证实sp1对成肌分化的重要作用以及skip可能参与骨骼肌细胞分化进程。
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