分子实验步骤.docx

分子实验步骤.docx

《分子实验步骤.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子实验步骤.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

分子实验步骤

报告一：

克隆基因、筛选与表达

PCR基因扩增及扩增产物的回收

一、PCR扩增目的基因AKP

反应体系（50uL）：

ddH2O35.7uL

2.5mmol/LdNTP4uL

10xbuffer5uL

引物sense（10umol/mL）2uL

Antisense2uL

模板DNA1uL

Ex－TaqE0.3uL（1.5U）

注：

最后加酶。

配体系时的注意事项：

将体系各成分加入管底；充分混匀；离心；冰上操作；保证管内无气泡；注意换枪头，防止交叉污染。

参数设定：

940C,5’

30次

940C,1’变性

550C,1’退火

720C,2’延伸

720C,10’补齐

二、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

1、凝胶配制：

0.8%琼脂糖凝胶30mL（用1xTAE配）；1.5uLGoldView；微波炉加热；倒胶插梳子；注意尽量去除气泡。

2、加样：

50ulPCR扩增产物+6ul10×loadingbuffer.

3、电泳：

恒压80V。

4、凝胶成像仪或紫外透射仪观察记录电泳结果。

三、扩增产物的回收

1.切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液，550C溶胶（一定要完全溶解）。

2.装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。

3.漂洗:

500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。

4.12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。

5.向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。

6.12000rpm,30秒。

7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。

8.12000rpm,2分钟。

9.SYBR检测回收产物

质粒DNA的提取及其定性定量分析

一、质粒DNA的提取

1、接含pETBlue-2质粒的单菌落于4mL含羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug/mL）的LB液体培养基中，370C，190rpm振荡培养过夜；

2、4000rpm、离心1min，弃去上层培养液收集所有菌体于一个小指管中；

3、150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min；

4、加入200uL溶液II（轻轻混匀!

裂解时间不超过5min），室温静置菌液裂解变清；

5、加入200uL溶液III（轻轻混匀!

），冰上静置15min质粒DNA复性

6、12000rpm，离心10min取上清

7、上清加等体积的酚：

氯仿：

异戊醇（旋涡混匀）

8、12000rpm，离心5min取上清

9、上清加等体积的氯仿：

异戊醇（旋涡混匀）

10、12000rpm，离心5min

11、上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温30min

12、12000rpm，离心10min

13、沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）

14、12000rpm，离心5min

15、沉淀于超净台中风干

16、沉淀加入20uLRTE，600C水浴30分钟溶解

17、-200C保存

二、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

1%琼脂糖凝胶20mL（用1xTAE配）

1xTAE120mL

2uL质粒DNA+0.5uL10xloading

80伏恒压电泳

结果用凝胶成像仪分析照相

三、质粒DNA的紫外吸收分析

质粒DNA用TE缓冲液稀释200倍（总体积300ul），测定A260和A280.

限制性酶切和链接

一、质粒DNA和目的DNA的双酶切

酶切反应体系（20uL）

管号

核酸

10xbufferK

ddH2O

BamHI

HandIII

tube1

目的基因AKP

24uL

3uL

0uL

2uL

1uL

tube2

pETBlue-2

10uL

2uL

5uL

2uL

1uL

37℃保温3小时。

二、酶切产物的纯化和回收

1%琼脂糖凝胶25mL（用1xTAE配）

1xTAE120mL

酶切DNA4ul+0.5uL10xloading

未酶切质粒DNA2ul+0.5uL10xloading

Maker5ul

80伏恒压电泳

结果用凝胶成像仪分析照相

接着进行扩增产物的回收，每100mg胶用700ul溶胶液来溶解，步骤同第一个实验中扩增产物的回收。

三、载体和AKP的连接

连接反应体系（20ul）

目的基因AKP

载体pETBlue-2

10xLigasebuffer

ddH2O

T4DNA连接酶

14ul

2ul

2ul

0

2ul

14℃水浴保温过夜

感受态细胞的制备、连接产物转化克隆菌株

一、感受态细胞的制备

1.预培养：

接NovaBlue单菌落到含12.5ug/mLTet的3mLLB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜

2.取0.4mL预培养菌液转移到含12.5ug/mLTet的40mLLB液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD600=0.4-0.5）

3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min

4.40C，4000rpm，离心10min

5.到出培养液，将管倒置使培养液流尽

6.菌体加入预冷的0.1mol/L的CaCl210mL，用5mL枪头轻轻吹散菌体细胞，冰浴30min

7.40C，4000rpm，离心5min，去上清

8.用冰预冷的0.1mol/L的CaCl22mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作

9.分装细胞200uL/份，此为感受态细胞（也可于-700C或-200C冻存）

二、连接产物的转化

1、取200uL感受态细胞，加入连接产物10uL

取200uL感受态细胞，加入质粒DNA2uL（5－50ng）（阳性对照）

取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照）

取200uL0.1mol/L的CaCl2，加入连接产物2uL（阴性对照）

用枪头混匀，冰上放置30min

2、420C水浴热激90秒

3、冰浴2分钟

4、每管加800uLLB液体培养基，370C慢摇1小时（150rpm）

5、将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去900uL上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取50uL细胞悬液直接涂布在选择平板上，正置30分钟后倒置培养过夜（370C）

6、将白色单菌落（蓝斑周围的）接入4ml含抗生素（50ug/mlCarb和12.5ug/mlTet）的LB液体培养基中，震荡过夜。

重组子筛选

一、提取质粒

1、接白斑于4mL含羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug/mL）的LB液体培养基中，370C，190rpm振荡培养过夜。

2、4000rpm、离心1min，弃去上层培养液收集所有菌体

3、150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min

4、加入200uL溶液II（现用现配轻轻混匀!

裂解时间不超过5min），室温静置菌液裂解变清

5、加入200uL溶液III（轻轻混匀!

），冰上静置15min质粒DNA复性

6、12000rpm，离心10min取上清

7、上清加等体积的酚：

氯仿：

异戊醇（旋涡混匀）

8、12000rpm，离心5min取上清

9、上清加等体积的氯仿：

异戊醇（旋涡混匀）

10、12000rpm，离心5min

11、上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温30min

12、12000rpm，离心10min

13、沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）

14、12000rpm，离心5min

15、沉淀于超净台中风干

16、沉淀加入20uLRTE，600C水浴30分钟溶解

17、-200C保存

二、重组质粒的酶切分析:

37℃酶解1-2小时

三、电泳分析重组质粒

1、1％琼脂糖20mL，含1uLGoldViewTM,80V

2、未酶切质粒

（用未重组的pETBlue-2作为Marker－M1）3uL质粒＋0.5uL10xloadingbuffer

3、酶切质粒

（用标准DNA分子作为Marker－M2）9uL质粒＋1uL10xloadingbuffer

重组质粒转化表达菌株

一、感受态细胞的制备

1.预培养：

接TunerTM（DE3）placI单菌落到含34ug/mLCam的4mLLB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜

2.取0.4mL（400ul）预培养菌液转移到含34ug/mLCam的40mLLB液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD600=0.4-0.5）

3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min

4.40C，4000rpm，离心10min

5.倒出培养液，将管倒置使培养液流尽

6.菌体加入预冷的0.1mol/L的CaCl210mL，用5mL枪头轻轻吹散菌体细胞，冰浴30min

7.40C，4000rpm，离心5min，去上清

8.用冰预冷的0.1mol/L的CaCl22mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作

9.分装细胞200uL/份，此为感受态细胞（也可于-700C或-200C冻存）

二、转化

感受态细胞200uL，加入2uL阳性重组质粒

感受态细胞200uL，加入2uLpETBlue－2

感受态细胞200uL，加入2uL无菌双蒸水（阴性对照）

0.1mol/LCaCl2溶液200uL，加入2uL阳性重组质粒（阴性对照）

用枪头混匀，冰上放置30min

420C水浴热激90秒

冰浴2分钟

加入800ulLB液体培养基，37oC，150rpm/min，30min。

取50ul细胞悬液直接涂布在含50ug/mLCarb和34ug/mLCam的平板上。

37oC12-16小时。

碱性磷酸酶的原核表达

1、预培养：

分别接一含pETBlue－2－AKP表达质粒和pETBlue－2的单菌落到3mL含50ug/mLCarb、34ug/mLCam和1％Glucose（葡萄糖）的LB液体培养基中，370C、190r/min振荡培养过夜；

2、将过夜培养的菌液0.5mL接种于35mL含50ug/mlCarb和34ug/mlCam的表达培养基中，370C、250rpm振荡培养3小时，至OD6000.6-0.8；

3、加入IPTG（终浓度：

50umol/L），继续在370C、250rpm振荡培养5小时；

4、40C，6000rpm离心10min，菌体沉淀在－200C冻存。

表达产物（AKP）的酶活性检测

一、细胞破碎

1.菌体加入15mL匀浆液

2.超声破碎（超声探头入水深度：

 1.5Cm左右，液面高度最好有30mm以上，探头要居中，不要贴壁。

超声波是垂直纵波，插入太深不容易形成对流，影响破碎效率）：

输出功率1200w，超声2秒，

间隔10秒，超声次数：

40次

3.细胞破碎液200uL＋4x样

品处理液100uL,90℃5min（室温保存SDS电泳备用）

4.取1.0mL细胞破碎液，4℃12,000rpm离心10min

5.留取离心上清液（酶）200uL＋4x样品处理液100uL,90℃5min（室温保存SDS电泳备用）

三、酶活性分析

SDS-PAGE和Westernblotting

一、SDS－PAGE

1.洗净胶板，架好和固定好胶板

2.配置12%分离胶（20mL）

3.分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约20－40min后胶自然凝聚

4.倾斜倒出蒸馏水，配制5%浓缩胶（10mL）

5.浓缩胶混匀后加入两玻璃夹缝

6.在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子，浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽，在槽中加入1×SDS电泳缓冲溶液，小心拔出梳子

7.电泳加样：

将样品12,000r/min室温离心10min后，按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（20－30uL）和标准样品（10uL）

8.电泳：

接通电源，电压设定为80V开始电泳，当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在100V,当溴酚蓝移动到离底部时，切断电源，停止电泳

9.将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶切成两部分

10.含蛋白标准的凝胶部分用R250染色、脱色和观察结果

二、免疫分析

1.另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟

2.正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（NC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压另一极上（注意不要有气泡）

3.恒流1.0mA/cm2，电转移1.5hr

4.转移结束后将NC膜取出，用1xPBS溶液配制的5%脱脂奶粉40C封闭过夜,凝胶继续用R250染色以便分析转移的完全程度

5.倒去封闭液，加入1xPBS稀释的一抗（稀释的倍数为ELISA所测效价的1/10），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。

370C轻轻摇动，孵育45min

6.1xPBS清洗3次后（每次漂洗5min），加入按1：

200倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。

37℃轻轻摇动，孵育45min

7.1xPBS清洗3次（每次漂洗5min），用显色液显色至出现清晰条带，加水冲洗终止显色反应。

报告二：

基因组DNA的分离与Southern杂交

一、小鼠基因组DNA的提取

1、取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎

2、碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆6次（冰上操作）

3、匀浆液转入2mL小指管，4℃,5000rpm离心2min,

4、沉淀加0.8mL无菌水，吹散，分成两份，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀

5、55℃水浴酶解过夜，4℃存放

6、加RNase,终浓度200ug/mL，37℃保温60min

7、加入等体积的酚：

氯仿：

异戊醇轻轻混匀

8、12000r/min离心5分钟，用扩口枪头将上清转入一新管中

9、加入等体积的氯仿：

异戊醇，轻轻混匀

10、12000r/min离心5分钟，用扩口枪头将上清转入一新管中。

重复一次

11、加入1/10体积的醋酸钠（3mol/LNaAcpH5.2），2倍体积的无水乙醇

12、轻轻旋转小指管，可见珠状絮丝，即为染色体丝，用枪头小心吸出液体

13、染色体丝用75%乙醇洗涤2次（每次10000r/min离心5分钟）

14、室温下稍干，加0.2mLTE4℃溶解过夜

二、基因组DNA的酶切

1、在灭菌的1.5mL管中，按下表准备酶切反应体系

2、37℃保温两小时

3、加入1／10体积的3mol/LNaAcpH5.2和2倍体积的无水乙醇

4、室温沉淀20分钟

5、12，000r/min离心10分钟

6、室温干燥

7、加入10uLTE溶解

三、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳

0.7-1%琼脂糖凝胶25mL（1×TAE）,含1uLGoldViewTM

加样：

DNAMarker8uL（DL15000或DL2000+）

质粒（T-载体-643bp）10uL＋1uL10×loadingbuffer

酶切产物（鼠肝）10ul＋1uL10×loadingbuffer

基因组DNA（鼠肝）6ul＋0.6uL10×loadingbuffer

电泳：

恒压80V电泳

当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后，停止电泳（电泳时间在1小时左右）

凝胶成像仪观察和记录电泳结果

四、Southern转膜

1、（注：

以下操作要戴上一次性手套）用刀片切掉未用过的凝胶区域，并将凝胶切掉一个角（对点样顺序做个标记），然后转至玻璃平皿中

2、在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15分钟，并轻轻摇动

3、更换变性液继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻摇动

4、将带正电荷的尼龙膜裁成比凝胶大一毫米大小，并在相应位置上剪掉一个角，再切六张与膜一样大小的滤纸，先用重蒸水浸湿再放入碱性转移缓冲液中浸泡约30min

5、制作夹心饼式的结构（由下至上）:

三张潮湿的滤纸\膜\凝胶\三张潮湿的滤纸（胶与膜的切角对齐,千万不要有气泡）

6、在玻璃板上先放上约10cm高的纸巾上，并在其上放上10层同样大小的干滤纸，将夹心饼结构放到其上

7、在其上放两层浸湿转移缓冲液的滤纸（滤纸的两端浸入转移缓冲液中）

8、盖上盖子，让凝胶上的DNA下行转移16小时或过夜

五、Southern预杂交

1、将膜塞入热密封袋中，按每平方厘米0.2mL加入预杂交液

2、尽量将袋中的空气全部挤出，用热封口机密封袋的开口两次

3、轻轻挤压袋子以检查密封的强度是否完整

4、将袋子放在65℃恒温水浴中预杂交过夜

六、Southern杂交

1、迅速将装有膜的塑料袋从水浴中取出，用剪刀剪开一角打开袋子，将预杂交液倒出

2、小心取出膜，转入装有5ml杂交液（含有探针的新鲜预杂交液）的袋子中，尽量将袋中的空气全部挤出

3、热封机封口，轻轻挤压袋子以检查密封的强度是否完整

4、将袋子放在62℃恒温水浴中杂交16小时或过夜

七、洗膜

一洗：

2×SSC＋0.1%SDS15min×2，室温慢摇

二洗：

1×SSC＋0.1%SDS15min×2，室温慢摇

三洗：

0.5×SSC＋0.1%SDS20min×2，65－68℃慢摇

四洗：

0.1×SSC，15min，室温慢摇

八、检测

1、将膜放入洗涤液中，在15－25℃振摇5min

2、将膜放入封闭液中，保温40min

3、将膜放入抗体溶液（用封闭液1：

5000稀释DIG－Ab－AP）中，保温30min

4、用洗涤液洗涤膜两次，每次20min

5、将膜放入检测缓冲液中，平衡2－5min

6、将膜放入2mL新鲜准备的有色底物溶液（2mL检测缓冲液＋40uLNBT/BCIP）中，避光使可见的有色斑点产生（千万不能摇动）

7、待颜色达到所需的程度时，用无菌水或TE浸泡5min即可终止反应

报告三：

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、植物总RNA的提取

1、准备细胞裂解液，2.0mL小指管充分混匀：

0.8mL变性液（异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中）

0.2mL2mol/LNaAc（pH4.0）（去除多糖，提供酸性环境）

0.6mL水饱和酚（去除蛋白质和DNA）

2、组织及细胞的破碎：

萌芽五天左右,大约5cm的小麦黄化苗0.2g，立即液氮研磨成粉末状,并尽快转入细胞裂解液中，剧烈振荡至组织分散，室温放置30钟

3、纯化总RNA（杂质的去除）

12000r/min,10min

取上清至2.0mL小指管中（弃沉淀，注意杂质的污染）

加入氯仿0.3mL，剧烈振荡15s（旋涡混匀），室温静置5min

12000r/min,10min

水相转入1.5mL小指管中（弃有机相，注意杂质的污染）

4、纯化总RNA（浓缩纯化）

加0.5倍体积的异丙醇和0.5倍体积的RNA沉淀液，充分混匀

室温静置30min，12000rpm离心10min

沉淀用1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗两次

每次12000r/min，5min

室温稍干燥（5-10min）

沉淀加20uLDEPC水,650C，10min溶解RNA

二、琼脂糖凝胶电泳分析总RNA

1、1％琼脂糖胶20mL，电泳缓冲液1XTAE（用DEPC水稀释）

1μLGoldView

2、6μL样品＋1μL10xloadingbuffer，混匀上样

3、80V恒压电泳20分钟，紫外灯下观察结果

三、小麦总RNA的紫外吸收分析

小麦总RNA用DEPC水稀释100倍（总体积400uL），测定OD260和OD280

四、RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）

1、阳性对照RT-PCR的cDNA第一链的合成（RT）

10uL反应体系：

2xBca1stbuffer5uL

MgSO4（25mM）2uL

dNTPMixture（10mMeach）0.5uL

H2O0.5uL

OligodTPrimer0.2uL

R-1Primer0.5uL

RNaseInhibitor（40U/uL）0.3uL

BcaBESTpolymerase（22U/uL）0.5uL

阳性模板0.5uL

进行如下循环：

65℃，1min；30℃，5min；15min内从30℃匀速升温到65℃；65℃，30min；98℃，5min；5℃，5min。

2．阳性对照RT-PCR的PCR扩增

①在0.2mLPCR管中，加入下列试剂混匀即为溶液I：

5xBca2ndbuffer4uL

MgSO4（25mM）1.5uL

F-1引物0.25uL

R-1引物0.25uL

Bca-OptimizedTaq0.2uL

H2O13.8uL

②PCR体系的建立

取5uLRT产物加入上述已准备好的溶液中

③按下列程序进行PCR扩增

94℃,5’

30次

94℃,1’

60℃,1’

72℃,2’

72℃,10’

④扩增产物的分析

1％琼脂糖凝胶20mL，1XTAE

3、实验样品RT-PCR的cDNA第一链的合成（RT）10uL反应体系

2xBca1stbuffer5uL

MgSO4（25mM）2uL

dNTPMixture（10mMeach）0.5uL

H2OYuL

OligodTPrimer0.2uL

特异的下游引物0.5uL

RNaseInhibitor（40U/uL）0.3uL

BcaBESTpolymerase（22U/uL）0.5uL

总RNAXuL（0.5ug）

进行如下循环：

65℃，1min；30℃，5min；15min内从30℃匀速升温到

65℃；65℃，30min；98℃，5min；5℃，5min。

4、实验样品RT-PCR的PCR扩增

①在0.5mL小指管中，加入下列试剂混匀即为溶液I：

5xBca2ndbuffer8uL

MgSO4（25mM）3uL

特异上游引物引物0.5uL

特异下游引物引物0.5uL

Bca-OptimizedTaq0.4uL

H2O27.6uL

②PCR体系的建立

在0.2mLPCR管中，按下表配制PCR反应液，25uL反应体系

③按下列程序进行PCR扩增

94℃,5’

30次

94℃,1’

60℃,1’

72℃,2’

72℃,10’

④扩增产物的分析

1％琼脂糖凝胶20mL，1XTAE