Western Blot个人版概述.docx
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WesternBlot个人版概述
WesternBlot实验方法
一蛋白提取
1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。
2、配置裂解液：
980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul蛋白酶抑制剂混匀机混匀。
3、每EP管中加裂解液（10ul/1mg），超声（time--pulse--AMPL--start--O）5s停5s循环1min,振幅25%（AMPL参数）,再裂解30min。
4、于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。
5、用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：
（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul样品，另加一个标准品BSA（10ul/ml）对照组，一个空白对照组。
6、（4倍）上样缓冲液稀释成（1倍），即:
30ul上清液+10ul（4倍）上样缓冲液（红色的，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。
7、测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。
比色皿水洗+酒精洗。
8、建Excel：
（一）Cx=Ax/A标。
C标（C标=10ug/ml,由30ul稀释至40ul,A标已经知道的）
（二）一般上样量为：
30ug,故:
30ug上样量/（0.75Cx）=V上样（ml）
由
（一）
（二），得：
V上样=A标/Ax.4
二配胶
1、提前配板：
洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶：
10％分离胶5％浓缩胶
10ml（两快板）15ml（三快板）4ml（l两块板）6ml（三块板）
H2O4.0ml5.9ml2.7ml4.1ml
30％丙稀酰胺3.3ml5ml670ul1.0
Tris-HCL2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml0.50ml（1.0M，Ph6.8）0.75ml
10％SDS100μl150ul40μl60ul
10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl150ul40μl60ul
TEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl6ul4μl6ul
2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。
3、制好胶的玻璃板，仔细观察可以看到一条水平的折线，如若不用，浸泡在电泳液里。
三上样及电泳
1、电泳液的配制：
up水（1000ml）,tris（3.03g）,甘氨酸（18.8g）,SDS（1.0g）.
2、将两块配好胶的玻璃板薄面相对，夹好（注意对齐，防止漏液），中间倒入电泳液（注意拿错电泳架，分为：
有电机的和无电极的），一般两块板的电泳液加到下面的线下面，四块板就加到上面线的刻度下。
3、若电泳液不渗漏，即可拔去梳子（注意两边同时用力，平整拔出）。
4、按上样量点样，每块板子第一孔为Mark（上样量为8-10ul），后面为样品，不用样品间换枪头。
5、将点好样的胶板放入电泳槽，槽内加适量电泳液，注意正负极连接.
6、打开开关，调整电压（80V）、电流（250mA）时间（30min），开始电泳,结束后，调节电压（110V）、时间（60min）。
四转膜
1、转膜液的配制：
up水（800ml）,tris（3.03g）,甘氨酸（14.4g）于40C置于冰箱，用时加甲醇200ml（20%）搅拌混匀。
（记得用的时候要加啊）
2、按海绵大小剪滤纸（上下共8张）、NC膜，放在电泳槽内，使之与转膜液充分浸泡.
3、将转膜夹打开，透明面（正极）朝下，上面依次放置：
海绵、滤纸（4张）、NC膜、胶带、滤纸（4张）、海绵（胶带与膜之间不要有气泡），然后将黑色面压下，夹好,注意NC膜一直要保持湿润。
4、电泳完毕后，将玻璃板拆卸下来，薄板和厚板分离（小心避免撬碎玻璃板）；
将带有胶的板子下方衬白色滤纸，读出Mark标记，用绿色小平板撬开玻璃板，将浓缩胶去除，将分离胶切去左上角以标记正反面，将胶放入平皿，平衡30min；根据标记切胶（切割时注意水平），选取含有目的蛋白的胶条（ASIC蛋白分子量72，为兔抗。
Actin作内参考43，为鼠抗），切好的蛋白胶条放在转膜液里浸泡一下以减小表面张力，铺胶带时，注意条带的左右顺序，用圆珠笔标记。
5、放入4℃冰箱，连接电极，黑对黑，红对红，打开电源，调整电压（300V）、时间（1.5h），开始转膜。
（总蛋白：
100-130,40-55）
六封闭
1、配制TBST缓冲液:
UP水（996ml）,NacL（8.5g）,Tris（6.057g）,用盐酸调Ph值至7.5-7.6（4管0.9mlHcl）,最后加Tween20（500ml），注意Tween20粘稠，将枪头去尖嘴后吸取。
2、配制封闭液：
一般配制的是BSA（5%）:
40mlTBST+2.0gBSA,置于塑料器皿或半个牛奶盒中，于摇床摇匀1.0小时。
3、一抗孵育：
（1）1%的BSA配制：
称取0.04gBSA加到装有4mlTBST溶液的4ml小管中。
（2）配制一抗缓冲液配制1%的脱脂奶粉与TBST液中（W/V）,按1:
200稀释ASICI抗体。
（本实验室：
1%的BSA：
一抗=4ml:
1ul，一般每条带2ml）.（具体见抗体说明书）
（2）用压塑机做塑料袋（先封住相邻两边，每边封两道防漏，尽量撑展），将膜取出移入塑料袋中，标记，正面向上。
然后再封住一边，加入一抗缓冲液5ml，排气泡，封最后一边；放在4℃冰箱的摇床上摇动（正面朝上，尽量用最快速度），过夜（一般大于18小时）。
（3）剪开塑料袋，将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜，10min×3次,一抗回收，放入冰箱。
4、二抗孵育：
（1）1%的BSA配制：
称取0.04gBSA加到装有4mlBTST溶液的4ml小管中。
（4）二抗缓冲液的配制：
配制1%的脱脂奶粉与TBST液中（W/V）,稀释HRP标记的二抗（GLU用兔抗:
1:
3000，β-actin用鼠抗：
1:
3000）（本实验室：
1%的BSA：
二抗=4ml:
1ul，一般每条带2ml）.（具体见抗体说明书）
（2）用压塑机做塑料袋（先封住相邻两边，每边封两道防漏，尽量撑展），将膜取出移入塑料袋中，标记，正面向上。
然后再封住一边，加入二抗缓冲液5ml，排气泡，封最后一边；放在摇床上摇动1.0小时（正面朝上，尽量用最快速度）。
（3）剪开塑料袋，将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜，10min×3次。
七化学发光检测
1、取出化学发光试剂盒（4℃避光保存），在开启之前平衡至室温。
黑白瓶各取2ml，共4ml（要求的体积是膜面积×0.125ml），吹打混匀。
垫保鲜膜，将膜正面朝上置于保鲜膜上，加2ml混合的检测试剂于膜上，饭盒盖盖住，室温孵育5min；吸掉发光液，放入化学发光仪（Omega16ic）内检测：
化学发光曝光10－15min。
2、将WesternBlot产物进行条带灰度分析，用Gel-ProAnalyzer专业分析软件读取IOD值。
以目的蛋白的IOD值/内参的IOD值半定量蛋白的水平。
结果进行方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
WesternBlot实验
成功完成WesternBlot检测，必须满足4个条件：
（1）凝胶洗脱：
转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
（2）吸附到膜上：
在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析（3）处理期间仍截留在膜上：
在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上（4）处理过程中可接近：
被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！
一般需要设置的对照如下：
阳性对照：
明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
阴性对照：
明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
二抗对照：
不加一抗，用于检测二抗的特异性
内参对照：
检测标本的质量和二抗系统
空白对照：
不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
WB检测基本过程
1、获取细胞或组织裂解物
1）根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
蛋白位置
推荐buffer
全细胞
NP-40orRIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40orRIPA
核蛋白
RIPAor核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPAor线粒体分离试剂盒
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2）选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：
Bradfordassay,Lowryassay或BCAassay。
定量后，可根据情况将标本保存在-20°C/-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态
凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
Reduced-Denatured
还原，变性
含β-巯基乙醇或DTT，含SDS
含SDS
Reduced-Native
还原，不变性
含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS
不含SDS
Oxidized-Denatured
不还原，变性
不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS
含SDS
Oxidized-Native
不还原，不变性
不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS
不含SDS
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
蛋白分子量（kDa）
凝胶浓度（％）
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8
4、转膜
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。
常用的转移膜类型有:
PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
各种膜的技术参数及比较如下：
PVDF膜
NC膜
尼龙膜
灵敏度和分辨率
高
高
高
背景
低
低
较高
蛋白结合能力
100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）
80-100ug/cm2
>400ug/cm2
机械强度
强
干的膜易脆
软而结实
溶剂抗性
强
差
差
使用前是否需要浸润
100%甲醛润湿
缓冲液润湿
缓冲液润湿
适用染色方法
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁
不能用阴离子染料
适用检测方法
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测
显色法、化学发光、荧光、放射性
显色、化学发光、放射性
适用范围
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。
0.1um膜适用于7kDa以下蛋白
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价格
高
较低
低
5、封闭
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。
常用的封闭溶液有：
含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：
选择一抗有以下几个注意点：
选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。
由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。
如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:
100-1:
3000）。
孵育条件：
推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
内参的选择和使用：
WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！
WB常用内参及其技术参数：
内参名称
分子量大小
适用范围
beta-actin
43kDa
胞浆和全细胞
GAPDH
30-40kDa
胞浆和全细胞
Tubulin
55kDa
胞浆和全细胞
VCDA1/Porin
31kDa
线粒体
COXIV
16kDa
线粒体
TBP
38kDa
细胞核
7、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。
如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:
1000-1:
20000）。
孵育条件一般为室温1-2小时
8、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。
一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
Note：
从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min
针对样品的常见问题
（1） 做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。
是什么原因？
蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：
怀疑是样品问题，可能是：
1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查WesternBlot过程， 提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几种蛋白酶抑制剂。
（2） 同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？
解答：
当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：
如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
（3） 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：
你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
（4） 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？
积层胶的浓度又该用多少？
这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？
解答：
260kd的蛋白不好做， 分离胶用6％，StackingGel成层胶3.5％。
（5）如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：
可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
（6）蛋白变性后可以存放多久？
解答：
－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：
不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
（7） 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
解答：
上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
（9）接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？
好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：
不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：
WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。
所以拿到好的结果不容易。
（10）BDNF组化不好做,我以前也作过,换了很多抗体,好像结果也不漂亮.染色比较淡,有点像非特异性.
建议:
1.换抗体,个人比较喜欢CHEMICON的,SANATCRUZ什么的千万别用,做WB还行,组画根本不能用.
2.可以尝试组画的增强法,就是通过化学药物使DAB颜色又棕黄变成深蓝,增加与背景的对照.
3.不要用goat,sheepchicken的抗体,尽量用mouse,rabbit的,否则北京很强.
4.增加一抗抚育时间,可以4度48小时，现有的抗体无论是SantaCruz、sigma还是一些实验室自己做的BDNF抗体都存在一个无可回避的问题，就是抗体的专一性不好，而且是及其不好。
为此上周在美国刚刚结束的Nuerotrophin年会就BDNF的抗体问题专门进行过一些讨论，其中鲁白的实验室用BDNFKnockOut的小鼠样品和Wt对照认为：
Pro-BDNF主要是34kd左右的那一条带，而matured-BDNF大概在14kd左右。
我们实验室在cell上overexpressBDNF的样品也证实在两条带是BDNF应该有的带。
但我的WB实验结果发现34kd那一条带实际上是有4-6条小的band组成，只是有时候因为信号太强而”融合“才显示为一条带。
具体那一条是真实的Pro-BDNF无法证实。
而且更重要的是在50kd以上有多条很强的band，其强度远大于14/34kd的band。
由此可见如果你用现有的抗体做免疫组化的话从根本上来说就是不对的。
你不妨用武大博士的抗体做一个WB试试看是不是我所说的那样。
我认为目前唯一可行的是分离你的目的脑区Ctx，Stn……etal来做WB。
取14/34kd的带作为你的presentation。
或者检测mRNA含量也能够从一定程度上反映出BDNF的变化。
PBS水化后加0.3%TritonX100通透30min后再加H2O2试试，有的抗体需要通透后才能染上，然后一抗孵育时间也可以适当延长，延长至48h。
一点小经验。
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