选择正确的缓冲液.docx

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选择正确的缓冲液

P186

选择正确的缓冲溶液

右表所示为常用缓冲溶液系统表。

表中列出一部分常用缓冲溶液及其相应的pH值。

其中，最常用的是磷酸盐。

作为一种缓冲溶液，当不同pH值的样品加入到其中时，应当具有保持pH稳定的能力。

同时，缓冲溶液的缓冲容量为酸或碱的pK值上下浮动100%。

在pH＝4时，磷酸盐时一种弱的缓冲溶液，如果一种酸性或碱性更强的样品加入到其中，其pH值会迅速朝着它的一个pKa值变化。

通常，为保持流动相pH值的稳定，流动相的pH值应控制在其pKa±1的范围之内。

在HPLC中，常用的缓冲溶液浓度为10-100mM。

具体的浓度取决于样品的尺寸和性质，以及色谱柱的填料。

通常，含有极性基团的固定相，如HypersilGoldaQ，比传统的烷基填料更适于在稀的缓冲溶液中使用。

若想控制流动相在一个低的pH值范围（2-3），通常会选择使用磷酸盐、或较强的有机酸，如TFA或醋酸。

若希望控制在pH4-5，醋酸盐或柠檬酸盐而不是磷酸盐，是通常考虑使用的试剂。

右图所示为pH值选择对分离的重要性。

如果不能正确缓冲，即使pH值微小变化，由测量的误差、泵混合物或者流动相吸收空气中的水所造成的变化，都会改变方法。

当选择一种缓冲溶液和有机溶剂混合时，应注意它们的互溶性，避免出现混合后缓冲盐结晶析出从而造成系统污染的情况。

订货号

流动相

流量

检测

实验完成后，应及时冲洗仪器和色谱柱，以防止缓冲盐沉积在系统或筛板上。

常用缓冲溶液系统

缓冲溶液

pKa

pH有效缓冲范围

是否适用与MS

三氟乙酸

0.30

是

磷酸盐

pK1

2.1

1.1-3.1

否

pK2

7.2

6.2-8.2

否

pK3

12.3

11.3-13.3

否

柠檬酸盐

pK1

3.1

2.1-4.1

否

pK2

4.7

3.7-5.7

否

pK3

5.4

4.4-6.4

否

甲酸盐

3.8

4.4-6.4

是

醋酸盐

4.8

3.8-5.8

是

三氨基甲烷盐酸缓冲液

8.3

7.3-9.3

是

氨

9.2

8.2-10.2

是

硼酸盐

9.2

8.2-10.2

否

二乙胺

10.5

9.5-11.5

是

碳酸盐

pK1

6.4

是

pK2

10.2

是

三乙醇胺

7.80

是

pH的微小变化对微离子化混合物分离的影响

P187

LC/MS缓冲溶液选择

缓冲溶液的选择很大程度上取决于所使用的仪器和分析物。

理想地，LC/MS系统中应使用易挥发的缓冲溶液以避免形成污染源极的沉积。

无机酸、不挥发的缓冲溶液以及离子对试剂应避免使用。

常用的LC/MS缓冲溶液包括：

●醋酸铵/甲酸盐/碳酸氢盐（<50mM）

●甲酸/醋酸（0.01-1%v/v）

●三氟乙酸（<0.1%v/v）

●叔胺（<0.1%v/v）以及氨型碱溶液

●TRIS

●BIS-TRIS丙烷

提示：

我公司可提供LC/MS仪器，如Finnigan™Surveyor™MSQ™LC/MS。

该系统中加入了自清洗装置以减小常规使用中无机盐在源极上的累积。

使用过程中应当注意，不要故意过度污染仪器的源极，因为这可能会导致操作上的问题。

流动相的准备

正确准备溶剂是十分重要的，它能在减少鬼峰和基线噪声问题上，节约大量时间。

质量

所有溶剂都应是高纯度的，HPLC级的溶剂的价格会比其它纯度的溶剂稍贵一些，但是它们的纯度是不同的。

HPLC级溶剂一般不会产生鬼峰，而其它级溶剂可能会由于杂质的存在而产生鬼峰。

保证配制流动相的水的纯度足够高，由于去离子水经常含有一些有机化合物，因此不推荐用于HPLC中。

超纯HPLC用水（18MΩ）是由去离子水通过离子交换床得到。

现代的水净化仪器即是利用这一机理来大量生产这种纯水。

HPLC纯水也可以从溶剂经销商处买到。

重要提示：

不要把HPLC纯水存放于塑料容器中，因为塑料中的添加剂可能会渗入水中造成污染。

通常用玻璃瓶存储HPLC纯水。

缓冲溶液

所有的缓冲溶液都应是现用现配的，这样能确保不会因为缓冲溶液储藏时间过长使流动相的pH受到影响，同时也可避免微生物生长。

pH的改变和微生物都可能会影响色谱分离效果。

缓冲溶液储存应该有一定的时间限制。

药典或者相关的资料都有一些相关要求。

缓冲溶液可能包含稳定剂，例如：

硫代硫酸钠。

这些稳定剂可能会影响缓冲溶液在光学和色谱方面的性能，因此，比较理想的是购买没有添加稳定剂的溶剂。

重复使用的固体试剂容器很容易被污染。

所以推荐买小容量容器装溶剂。

过滤

理想情况下，要求所有HPLC用溶剂都应通过0.45μm的滤膜过滤后再用。

这样能够有效防止微粒导致的堵塞。

过滤后，应把溶剂放在一个密封的容器中，防止灰尘等所造成的重新污染。

过滤后的溶剂既可做色谱分析，也可冲洗系统。

譬如，泵头、柱塞杆、单向阀和密封圈，都应该最大程度上处理好，保持良好性能状态。

脱气

在流动相进入HPLC系统中之前，应首先脱气。

常用的流动相脱气方法有：

●氦气脱气

●超声脱气

●真空脱气。

如果流动相没有脱气，那么进入到高压系统的气泡会使系统不稳，出现鬼峰等。

流动相中的气体引起的基线噪声

氦气或其他低溶解度气体是有效的脱气方法，流动相连续脱气可以防止空气重新溶解在溶剂中从而对实验产生影响。

注意：

确保溶剂瓶里有孔与大气相通，以防止溶剂瓶内部有压力。

P188

溶剂性质（vs硅胶）

溶剂

溶剂强度1

极性指数

紫外截止2（nm）

折光率2

粘度3（cP,20℃）

沸点3（℃）

水溶性（w/w%）

氟利昂

正己烷

异辛烷

正庚烷

正癸烷

环己烷

环戊烷

1-氯丁烷

正丁醚

邻二甲苯

异丙醚

甲苯

甲基叔二丁醚

正丁醇

氯仿

二氯甲烷

甲基丁基酮

四氢呋喃

互溶

环己酮

甲基乙基酮

甲氧醚环己醇

互溶

丙酮

互溶

二氧六环

互溶

乙酸乙酯

乙酸甲酯

二甲亚砜

互溶

N,N’-二甲基甲酰胺

互溶

硝基甲烷

乙腈

互溶

N,N’-二甲基乙酰胺

N-甲基酰胺

正丙醇（1-丙醇）

互溶

异丙醇（2-丙醇）

互溶

乙醇

互溶

甲醇

互溶

乙二醇

互溶

醋酸

互溶

水

1.L.R.Snyder,J.Chromatogr.Sci.,16（1978）223

2.BurdickandJacksonreferencetables（wavelengthat1.0absorbanceunits）.

3.CRCHandbookofChemistryandPhysics.

P189

溶剂互溶性

醋酸

丙酮

乙腈

苯

正丁醇

乙酸丁酯

四氯化碳

氯仿

环己烷

1,2-二氯乙烷

二氯甲烷

二甲基甲酰胺

二甲基亚砜

二氧六环

乙醇

乙酸乙酯

二乙醚

庚烷

己烷

甲醇

甲基叔二丁醚

甲基乙基酮

戊烷

正丙醇

异丙醇

二异丙醚

四氢呋喃

甲苯

三氯乙烯

水

二甲苯

不相溶的

那些阴影方格所示“不相溶”是指，两种溶剂在某种比例下混合，会产生两相。

P190

发色团检测波长

发色团是光吸收基团，可利用其测定分析物。

分析物通常有一个或多个检测波长，每个检测波长都有与其相应的摩尔吸收系数。

下表是部分常用发色团的相关信息，可供色谱分析参考。

发色团

结构

λmax（nm）

εmax（L/m/cm）

炔

-C≡C-

175-180

6000

醛

-CHO

210

强

280-300

11-18

胺

-NH2

195

2800

酰胺

>C=N-

190

5000

偶氮

-N=N-

285-400

3-25

苯

184

202

255

46,700

6,900

170

羧基

-COOH

200-210

50-70

酯

-COOR

205

50

醚

-O-

185

1000

烯

-C=C-1908000

酮

>C=O

萘

220

275

312

112,000

175

5600

硝酸盐

-ONO2

270

12

-（C=C）-无环

-（C=C）3

C=C-C=C

C=C-C=N

C=C-C=O

C=C-NO2

210-230

260

219

220

210-250

300-350

21,000

35,000

6,500

23,000

10,000-20,000

弱

氰

-C≡N

-ONO

160

220-230

300-400

1000-2000

10

硝基

-NO2

210

强

亚硝基

-N=O

302

100

肟

-NOH

190

5000

嘧啶

174

195

251

80,000

6,000

1,700

砜

-SO2-

180

亚砜

>S-O

210

1500

硫醚

-S-

194

215

4600

1600

硫醇

-SH

195

1400

氢离子型用25℃的0.1M的H2SO4溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4～16h。

用25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h。

用65℃的20/80的ACN/0.01MH2SO4溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h。

钙离子埋用85℃0.1mol?

LpH6.࠳的Ca（NO3）2溶液以0.1mL/mif的ⵁ量反ᐑ冲冼4～16h。

用25℃的20/80的乙腈/水溶涺以0/1mL/man的流量反向冲冼4h。

甈25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲䆼th。

钠离�型

用85℃的0.1mol/L!

pH6.3的Ca（NO3-2溶澲以0.1mL/min的流量反向冲冼4～16h。

用25℃的20/ĸ0的乙腈/水溶液䫥0.1mL/min的流量反向冲冼4h。

用25℃的2‰/80的乙腈/氶溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h。

铅离子型

用85℃的pH5.3的0.1MPb（NO3）2溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4～16h。

用25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h。

用25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h。

P192

GC方法选择和优化

下图所示为GC方法建立和优化的通用步骤。

其它在本产品目录中与之有关信息的页码均在图中标示出来。

改变固定相

极性柱对极性样品保留更强，反之亦然。

见P114

P193－195

GC故障排除

在开始故障排除之前，首先需查看相关的实验室安全规程。

了解试剂的理化性质及其相应的材料安全数据表（MSDS）。

同时，还需将所有的电器都关机并拔下其电源插头。

带好护目镜。

以下是GC实验中的常见问题、可能的原因及相应的解决方法。

现象

原因

解决方法

基线相关问题

基线漂移

固定相积聚。

除去色谱柱末端部分。

载气瓶压力太低，不易控制。

更换气瓶，增加压力。

载气或燃烧气流量波动。

检查气阀。

色谱柱污染。

检查气体的纯度，使用相应纯度的气体。

基线下漂

系统载气泄漏。

做泄漏测试，检查载气线路中的连接件是否拧紧。

色谱柱未老化好。

延长色谱柱的平衡时间。

基线从一个较高的初始值慢慢下漂。

在实验过程中，冲洗阀一直处于关闭状态。

改变GC程序。

具体方法参见仪器使用说明。

冲洗流速太低。

增加冲洗流速。

冲洗阀关闭时间过长。

缩短冲洗时间。

溶剂峰拖尾。

增强溶剂抑制，缩短冲洗时间。

前过滤器污染

（当使用四极杆质谱检测器时）

联系服务代表。

基线上漂

色谱柱内杂质堆积。

检查气体的纯度，使用相应纯度的气体。

检测器污染。

检查检测器，并清洗之。

GC柱泄漏。

检修色谱柱，更换色谱柱。

空气进入系统之中。

查找并修补泄漏点。

温度程序控制下的基线上漂。

色谱柱污染。

检修色谱柱。

基线稳定在高示值。

载气流速太快。

降低载气流速。

色谱柱污染

检修色谱柱。

气体污染。

更换气瓶，替换气体过滤器。

色谱柱固定液流失。

检查柱温，确保其不超过色谱柱的最高使用温度；修理色谱柱；更换色谱柱。

连接件未拧紧。

检查并确保所有的连接件及螺丝等都处于拧紧的状态。

基线形状不规则：

溶剂出峰后开始下降

检测器污染。

检测器退火。

清洗检测器。

基线不形规则：

S形

程序升温过程中色谱柱泄漏。

降低色谱柱的使用温度。

色谱柱退火。

更换一支耐温更高的色谱柱。

氧气污染导致固定相分解。

在气路上安装氧气过滤器。

检查气体系统及入口是否有泄漏。

使用氧气含量低的气体。

基线高频噪声

检测器污染。

将检测器与其它电子仪器隔离开。

如果噪声消失，清洗检测器。

燃烧气流速太低或者太高。

检查检测器的气体流速。

色谱柱污染。

检修色谱柱。

检测器气源污染。

检查气体纯度，安装相应的过滤器。

检测器温度高于色谱柱的最高使用温度。

将检测器温度下调至色谱柱的最高使用温度。

色谱柱接头松动。

拧紧接头。

基线出现尖峰

色谱柱离火焰太近（使用FID时）。

将色谱柱调整到合适的位置（喷嘴末端下2-3mm）

喷嘴或检测器污染。

将检测器与其它电子仪器隔离开。

如果尖峰消失，清洗喷嘴和收集器。

若使用FID，其温度太低。

将FID的温度至少调高到150℃。

谱峰相关问题

谱峰展宽

柱流量太快。

降低流量至微高于最佳值。

柱流量太低。

增加流量至微高于最佳值。

分流进样时，分流流量太低。

将流量增加至40-50mL/min。

柱效降低。

在最佳流速下测试色谱柱。

进样器污染。

清洗并更换衬垫。

固定相积聚在出口。

从柱中除去最后两卷。

检测器温度太低。

将检测器温度上调至色谱柱最高使用压力下5℃。

样品过载。

降低样品的进样量或者进样浓度。

出现双峰

进样速度太慢。

进样快速连贯。

错误的自动进样速度或模式。

快速进样。

前伸峰

柱或检测器过载。

减小进样量；降低分析物的浓度；增加分流比。

柱温太低

提高柱温。

固定相量太少。

使用一支膜厚更大的色谱柱。

进样技术欠佳。

反复练习，提高进样技术。

鬼峰

载气被污染。

更换气瓶，更换过滤器。

由玻璃器皿造成的污染。

清洗玻璃器皿，确保所使用的玻璃器皿干净，不会造成污染。

已进样的样品分解

降低进样口温度。

采用柱上进样技术。

样品溶液污染

样品进样前需进行充分的预处理。

宽的鬼峰

入口或气动装置污染。

卸下色谱柱，bakeout入口。

使用高质量的隔膜。

更换分流出口过滤器。

在气动装置和入口之间安装在线过滤器。

前次实验的样品未完全洗脱下来。

提高柱温箱最后的程序温度或总运行时间。

增加柱流量。

不规则椅装峰

色谱柱溶剂溢出。

提高初始柱温，减小进样体积（OC）。

安装一个保留缝隙（OC）。

溶剂峰后未见有谱峰

载气流速太快。

降低载气流速。

燃烧气流量错误。

检查燃烧气的流量。

检测器污染。

Bakeout或清洗检测器。

FID火焰被溶剂峰淹没。

检查检测器温度。

进样量过大。

减小进样量。

S/SL进样器上，色谱柱位置错误（太高）。

检查色谱柱的位置。

进样后不出峰

进样针阻塞。

更换或修理进样针。

色谱柱破裂或未连接。

检查色谱柱及连接。

电压计或放大器故障。

更换电压计，更换放大器。

记录仪故障。

更换记录仪。

FID火焰熄灭。

重新点燃。

电子连接件损坏或丢失。

检查电缆连接。

S/SL进样器上，色谱柱位置错误（太高）。

检查色谱柱的位置。

样品峰拖尾

色谱柱降解。

进样标准品混合物，测试色谱柱。

柱温太低。

提高柱温。

不要超过固定相的最高建议使用温度。

衬垫污染。

清洗或更换衬垫。

玻璃纤维或入口衬垫引起。

用硅烷化过的纤维及干净的入口衬垫替换。

入口温度太低。

提高入口温度。

柱接头堵塞或连接不好。

重置色谱柱入口接头。

固定相选择错误。

根据色谱柱生产厂商提供的文献资料重新选择色谱柱。

溶剂峰拖尾

色谱柱在进样口端位置不正确。

重新安装色谱柱。

初始柱温太高。

（柱上）

降低初始柱温。

隔膜净化流量太小，分流出口流量太低。

检查并调整隔膜净化装置及出口流量。

进样量过大。

减小进样量。

峰分不开

载气流速太高。

降低载气流速。

柱损坏。

更换色谱柱。

柱温太高。

降低柱温箱温度。

色谱柱过短。

更换一支更长的色谱柱。

色谱柱选择错误。

更换一支适合的色谱柱。

不恰当的进样技术。

选择正确的进样技术。

不连续、高相应值的污染物峰

从GC柱中流出

检修或更换色谱柱。

从隔膜流出

更换隔膜。

样品环隔膜污染样品

弃去样品。

将样品直立存于冰箱中。

使用一面有TeflonTM的隔膜，将Teflon面朝下（即朝向样品）。

结果相关问题

峰面积重复性差

样品浓度与检测系统的动态范围不相容。

确保样品浓度适合检测系统。

不恰当的进样技术。

尝试使用不同的进样技术。

不适合的进样参数。

检查进样温度。

检查流速。

非重复性的样品进样技术。

评价样品制备结果。

将实验结果与标准进样结果相比较。

进样针或衬垫泄漏。

定期检查并更换进样针。

定期检查并更换衬垫。

进样泄漏。

检查柱接头，启动泄漏检查。

进样技术差。

精确计算进样量。

使用一支干净、高质量进样针。

分流控制问题。

监测流量。

更换在线过滤器。

随着保留时间增加，灵敏度降低。

载气流速太低。

提高载气流速，查找并除去气路中可能存在的阻塞。

检查进样器/柱密封圈。

正常保留时间下灵敏度降低。

柱温箱或进样器参数未达最佳。

调整柱温箱或进样器参数。

GC气路泄漏。

启动泄漏测试，并修理之。

进样过程中，进样针泄漏。

更换进样针或活塞密封。

分流进样温度太低。

提高进样器的温度。

色谱柱柱效低，或者色谱柱类型选择有误。

检修色谱柱，更换色谱柱。

保留时间减少

氧气和/或水造成色谱柱性能下降。

使用不含氧气和水的载气。

由于色谱柱bleeding造成固定相流失

降低色谱柱温度。

保留时间增加

载气泄漏加剧。

检查隔膜和柱接头。

载气用完。

更换气瓶。

保留时间重复性差

气体控制器不稳定或漂移。

监测柱压或流量。

如果需要检查并更换控制器。

进样技术差。

进样后开始新一轮

进样量过大。

减小进样量和/或进样体积。

柱温不稳定

检查柱温箱门和散热器。

监测色谱柱温。

保留时间多变

GC柱破损。

检修色谱柱，更换色谱柱。

GC平衡时间不够。

增加平衡时间。

进样不佳。

用更好的进样技术重复实验。

程序升温太快。

减小程序升温梯度。

空气从进样器密封处或载气管路中泄漏进系统。

监测并修理之。

更多有关特殊检测系统信息，请联系我们索取故障排查指南。

P196

调整保留时间（tR´）

分析物的保留时间（tR）与死时间（tm）的差值。

tR´=tR-tm

调整保留时间也等于分析物在固定相上的停留时间。

容量因子（k）

容量因子表示分析物与不保留样品的出峰时间比值，其中，tR表示样品的保留时间，tm表示不保留样品的出峰时间。

容量的测定可帮助确定保留的变化是由色谱柱（容量因子随保留时间的变化而改变）还是系统（容量因子不随保留时间的变化而改变）引起。

k=（tR-tm）/tm

容量因子越大，保留时间越长。

柱效（N）

见理论塔板数。

色谱柱评价

在ThermoGC仪器上进行的应用，可测定色谱柱对流量的阻力，精确控制气体流量以确保一致的保留时间。

检测器

见ECD、FID、FPD、NPD、PID及TCD。

分配常数

溶质在固定相与流动相的浓度比例。

有效理论板数（Neff）

柱效的测试说明不保留洗脱时间的影响，tR´是指调整保留时间而s是指谱峰的标准偏差。

Neff＝（tR´/σ）2

这一值保持稳定，不受使用的保留gaps和guards。

基于峰宽计算的方法，