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微生物培训

卫生学、微生物学及洁净作业知识

一、微生物学基础知识

1、微生物定义

2、微生物特点

3、微生物的特征

4、微生物种类

5、细菌的生物学特性

6、真菌的生物学特性

7、药物生产中的微生物污染

8、影响微生物生长繁殖的主要因素

9、无菌与灭菌、消毒与防腐的定义、概念

10、灭菌方法概述

二、洁净作业、卫生要求

1、洁净区的概念

2、《药品生产质量管理规范（2010年修订）》对药品生产环境基本要求

3、药品生产洁净室（区）洁净度级别及监测

4、公司各药品生产车间洁净区（室）的洁净级别

6、洁净室（区）有害物质的来源

7、空调净化系统（基本知识简介）

8、洁净区的人员卫生、区域卫生、工艺卫生要求

一、微生物学基础知识

我们所生活的环境中，到处都存在着大量的微生物。

在一般空气中，微生物达800~3500个/m3，在土壤中达1~500×108个/g，在严重污染的水中可达107个/ml。

（饮用水要求细菌总数≤100个/ml，大肠杆菌≤3个/ml。

经水塔或贮水池贮存后，短期内可繁殖至105~106个/ml。

）人的头皮上有140万个/cm2，两手上约有4~40万个，1g指甲污垢有38亿个，1g粪便可达10~1000亿个。

可以说微生物是无处不在，无处不有。

许多以前被人们认为是极端（高温、高压、强酸、强碱、低温等）甚至是致死的环境，现在已发现生活着各种类型的微生物（称为极端微生物）。

事实说明，微生物有特别顽强的生存、繁殖和变异能力来适应环境。

微生物种类繁多，有的对人有益，有的有害，有的无益也无害。

但在药品生产过程中，不可能对环境中的各种微生物加以区别对待，为保证药品的安全有效，需要对其进行控制。

空气中的微生物多数附着在灰尘上，或以芽孢形式悬浮于空气中，1μm以下者处于悬浮状态，10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。

所以也要对尘粒进行控制。

人是洁净室最大的污染源，占90%左右。

一般男性每人每分钟向周围排放1000个以上的含菌粒子，女性为750个以上。

穿无菌服时，静止时的发菌量为10~300个/min，一般活动时发菌量为150~1000个/min，行走时发菌量为900~2500个/min。

咳嗽一次发菌量为70~700个/min，喷嚏一次为4000~60000个/min。

所以在洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。

1、微生物定义：

是一类形体微小、结构简单，大多数为单细胞，必须借助光学显微镜放大数千倍或电子显微镜放大数万倍才能肉眼可见微小生物的统称。

2、微生物特点：

个体微小、结构简单、进化地位低等。

3、微生物的特征：

3.1个体微小，比面大（最基础特征），大多数在μm级，需用光学显微镜放大数百倍或千倍才能看到，如，细菌和真菌；有些微生物的大小为nm，则需用电子显微镜放大数万倍才能观察到其形态结构，如病毒。

3.2具有一定的形态结构

3.3新陈代谢旺盛、生长繁殖速度快。

一般情况下，细菌20-30分钟即可繁殖一代。

3.4适应强、易变异。

3.5分布广、种类多（10万种以上）。

4、微生物种类，包括：

4.1原核生物类：

单细胞---细菌、放线菌、支原体、衣原体等

4.2真核生物类：

单细胞----酵母；多细胞----霉菌、原生动物、藻类

4.3非细胞类：

病毒、类病毒、朊病毒

5、细菌的生物学特性

5.1细菌是一类单细胞的原核细胞型微生物。

5.2细菌的基本形态：

有球形、杆形和螺旋形三类，分别称球菌、杆菌、螺形菌（分弧菌、螺菌），大多数球菌直径为1μm左右，杆菌一般长2-3μm，宽0.5-1μm。

5.3基本结构：

各种细菌有细胞壁、细胞膜、细胞浆和核质等基本结构。

某些细菌除具有上述基本结构外，还有一些特殊结构，如夹膜、鞭毛、菌毛和芽孢等。

5.4芽孢又叫内生孢子，是某些细菌在一定生长阶段在菌体内形成一个圆形或卵圆形的特殊结构。

一般认为芽孢是细胞的休眠体，对环境条件的抵抗力强，能保护细菌度过不良条件。

与芽孢相对而言，未形成芽孢而正在繁殖着的细菌叫做繁殖体。

芽孢对热、干燥、化学药品等有较强的抵抗力。

有的芽孢在自然界中可存活达数十年之久。

干热灭菌需160℃、2小时以上；高压蒸汽灭菌需121℃、15-30分钟才能杀灭芽孢。

芽孢抵抗力强的原因有：

1、芽孢含水量少，蛋白质受热不易变性；2、芽孢具有多层致密的厚膜结构（特别是芽孢壳），通透性低，能止化学物质等的渗入；3、芽孢形成时合成一些较繁殖体有更大抗热性的酶；4、芽孢内含有大量特有的吡啶二羧酸钙，它是在芽孢形成过程中合成的,同时芽孢也获得耐热性,当芽孢萌发时由芽孢内渗出，芽孢的耐热性也随之丧失。

细菌的生物学特性，有两点值得注意：

一是普遍存在的特性，它们以一种形式或另一种形式到处存在。

二是细菌能以极快的速度繁殖，20-30分钟即可繁殖一代。

还有细菌特性之一是具有产生修复休眠体芽胞的能力。

6、真菌的生物学特性：

真菌是有细胞壁，无叶绿素，无根、茎、叶分化的真核细胞型微生物，是微生物中种

类最多的一类，约十万余种。

真菌主要包括酵母菌、霉菌和大型真菌。

其实这些名称都不属于分类学上的名词。

酵母菌为单细胞，无菌丝，菌落形态似细菌的非菌丝体状的类型；

霉菌有单细胞或多细胞，由菌丝体和孢子组成，菌落疏松常能扩散生长的一些丝状真菌的统称。

大型真菌是一些肉眼可见的体积超常的类型，因其菌体体积大而得名。

如，木耳、灵芝、香菇、茯苓等。

酵母菌和霉菌这两大类微生物基本包括了真菌中除担子菌亚门（主要是大型真菌）外的各种类型。

真菌对营养要求不高，培养条件可概括为五字特点：

甜、酸、温、湿、慢。

一般说来，只要在培养基中供给一些糖类，如，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精作为碳原，多数真菌就能利用无机氮源或有机氮源来合成自身生长繁殖所需的各种物质。

真菌比其他更多微生物更容易培养，除营养要求较简单外，真菌对酸不太敏感，在pH值2-9的范围内均可生长，最适pH5-7。

生长最适温度为室温，一般为22℃。

大多数真菌为需氧菌，喜温好湿。

梅雨季节是真菌生长繁殖最适宜的时期。

因次，梅雨季节要特别注意防潮、防霉，要保持物料、设备、各种器具的干燥。

真菌生长速度比细菌缓慢，要几天才能形成典型菌落。

真菌种类繁多、分布广、有高度分解和合成有机物质的能力。

真菌已广泛地应用于医药工业生产以及酿造、食品、化工、皮革等方面，具有非常重大的实用价值。

同时，真菌引起的药物原料、制剂、工农业原料、产品以及食品的霉败变质，又有很大的破坏性。

有的真菌还是人类和动物的病原菌，如引起浅部真菌病的皮肤癣菌，引起深部真菌病的新型隐球菌、白色念珠球菌等。

中药材的收购、保管上要做到去土、干燥、通风、合理贮藏，主要是为了防霉。

在灭菌工艺微生物学中，真菌的孢子（包括酵母的孢子）对灭菌的耐受性比细菌的芽孢差。

7、药物生产中的微生物污染

药物生产和保藏的一个重要问题是微生物污染造成变质的问题。

在药物生产过程中，大多数制剂都含有微生物。

空气、水、操作人员、药物原辅料、设备容器具、包装容器、厂房环境等均可造成药物微生物的污染。

即使经过灭菌或除菌处理的注射剂也可能因热原存在而引起发热反应。

污染源及控制：

7.1空气中的微生物

空气中含有数量不少的微生物：

细菌、霉菌、酵母菌等。

空气中的微生物种类与数量随条件不同有很大的变化，如有活跃人群之处比人少的地方微生物多，不洁的房间比清洁的房间多。

当人们讲话、咳嗽、打喷嚏时，可大大增加空气中的微生物的数量。

下表是不同地区的大气含尘含菌浓度。

国内室外大气含尘含菌浓度

含尘（微粒≥0.5μm）浓度/（个/m3）

含微生物浓度/（个/m3）

工业区

（15-35）×107

（2.5-5）×104

市郊

（8-20）×107

（0.1-0.7）×104

农村

（4-8）×107

＜0.1×104

由于空气中含有微生物，因此药物制剂的生产过程中，对生产场所的空气中含有的微生物数量的限度要进行控制，不同药物制剂的类型的要求不同，在后面作详细的介绍。

7.2水中的微生物

水在制药工业中至关重要，因除在配制各类制剂时需要用水外，在洗涤及冷却过程中均涉及到水。

水也是药物中微生物的重要来源。

水中常见的微生物有假单胞菌、产碱杆菌、黄杆菌、产色细菌和沙雷菌等。

如受到粪便的污染时，则可有大肠埃希菌、变形杆菌和其他肠道细菌等。

因此，用于生产的工艺用水必须经处理符合水质的卫生标准。

饮用水，国家的饮用水的质量标准对微生物的规定：

细菌总数：

每1毫升不得超过100个，总大肠菌群：

每100毫升不得检出。

大肠菌群是指一群37℃、24小时能发酵乳糖，产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰阴性菌。

《中国药典》2015年版对纯化水、注射用水的微生物限度的规定。

纯化水，细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个；注射用水，细菌、霉菌和酵母菌总数每100ml不得过10个。

7.3人体中的微生物

自然界广泛存在着微生物，人与自然界相接触，因此人的体表及与外界相通的腔道如口腔、鼻咽腔、肠道、眼结膜、泌尿生殖道等都存在不同种类和数量的微生物。

其中，有些微生物可长期寄居于人的体表或与外界相通的腔道的黏膜上，当人体免疫力功能正常时，它们和宿主以及环境之间保持动态平衡，有益于宿主的健康，构成相互依赖相互制约的生态学体系，为人体正常微生物群，通称“正常菌群”。

正常菌群与宿主间的生态平衡在下列情况下可被打破，造成生态失调而导致疾病。

这样，原来在正常情况下不致病的正常菌群就成了条件致病菌。

（1）寄居部位的改变，例如大肠埃希菌从原寄居的肠道进入泌尿道，或手术时通过切口进入腹腔、血流等。

（2）免疫力低下时，由于应用抗肿瘤药物、大剂量皮质激素或放射治疗等，可造成免疫功能低下，从而使一些正常菌群从寄居原位穿过黏膜等屏障，进入组织或血流，出现各种病症，严重的导致败血症而死亡。

（3）菌群失调，使宿主某部位正常菌群中各菌种之间的比例发生较大幅度变化而超出正常范围的状态，由此产生的病症称为“菌群失调症”。

菌群失调时，往往可引起二重感染，即在抗菌药物治疗原感染性疾病过程中，发生了另一种新致病菌引起的感染。

菌群失调的原因是长期应用抗菌药物（尤其是广谱抗生素）后，大多数正常菌群被杀灭或被抑制，而原处在少数劣势的菌群或外来抗药菌乘机大量繁殖而致病。

从上可以看出，“正常菌群”既是人体健康所必需的，但也能成为条件致病菌而引起感染，同时也是医药工业微生物污染的重要来源之一。

微生物可以从操作人员传递给药物制剂，因此必须注意操作人员的个人卫生，应身体健康，有健康证，GMP明确规定“第三十二条　企业应当采取适当措施，避免体表有伤口、患有传染病或其他可能污染药品疾病的人员从事直接接触药品的生产”。

从事直接接触药品的生产的不得是带菌（如肺结核杆菌、痢疾杆菌、甲肝、丙肝病毒等）者。

在制药过程中要求戴口罩，清洗和消毒双手，穿上专用工作衣帽才能进入车间进行操作，以减少微生物污染。

7.4原辅料和包装材料

天然来源的未经处理的原辅料，常含有各种各样的微生物如动物来源的明胶、脏器，植物来源的阿拉伯胶、中药材等。

事先或制药过程中加以消毒处理可得到减少微生物的满意效果。

良好的贮藏环境条件，也可以防止或减少微生物的污染繁殖。

包装材料包括包装用的容器、包装纸、运输纸箱等应按不同要求考虑是否需要消毒和如何合理封装。

原则是尽量减少微生物的污染。

7.5生产厂房、生产设备容器具生产厂房的空气、生产设备容器具在生产规程中，和产品接触是难以避免的。

必须要符合要求，并按规定清洁消毒，以防止或减少微生物的污染繁殖。

8、影响微生物生长繁殖的主要因素:

营养物质、温度、pH、氧气、水的活度。

8.1营养物质：

①水分：

水占细胞浆的70%～90%，是细胞的重要组成成分。

较普遍的观点认为：

只有在含水的环境中微生物才能存活，特别是繁殖。

但也有人发现在无水碳氢化合物中微生物可长期存活。

②碳源：

碳源是构成细胞的重要物质。

有些微生物的碳源必须来自有机碳化合物如糖、蛋白质、脂肪、有机酸等（同时利用其化学能），属异养型；有些微生物不需有机碳化合物，以CO2为碳源，属自养型（分为光能自养型和化能自养型）。

③氮源：

氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。

④无机盐类：

细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。

其中磷、硫、镁、钾、钠、铁需要量较多，其他只需微量。

⑤生长因子：

生长因子是某些微生物生长发育所必需，而其自身又不能合成的一类营养物质。

包括维生素、嘌呤和嘧啶等。

8.2温度：

微生物适于生长繁殖要有适宜的温度，当超过其最低或最高可耐受的温度时，即停止生长或死亡。

一般细菌最适温度为30~40℃，真菌为20~30℃。

8.3pH值：

各种微生物都有其最适宜的pH值，大多数细菌最适pH为6.8~7.4，但一般有较大的容忍度，在4~9也可存活和生长，少数细菌能在极端pH值范围内生长。

真菌适于pH值3~6的微酸性环境，但在2~10也可生长。

8.4氧气：

大多数细菌和所有霉菌都是需氧菌（在有氧环境中才能生长），少数细菌是厌氧菌（在无氧环境中才能生长），有些细菌和酵母菌是兼性需氧厌氧的，在有氧或无氧环境中都能生长繁殖。

8.5水的活度：

水分活度简称aw（wateractivity）,其用来表征物质自由水含量，相对于水分含量水分活度才能反映物质的稳定性和微生物繁殖的可能性，更能准确控制微生物的生长，因为水分含量包括结合水和自由水二种形态，而微生物或生化反应与结合水无关，是与自由水密切相关，所以是预防物质腐败和质量安全的重要关键因素。

水分活度数值用Aw表示的，水分活度值等于用百分率表示的相对湿度，其数值在0-1之间。

溶液中水的蒸气分压P与纯水蒸气压Q的比值，Aw=P/Q。

有资料记载水分活度（而不是水分含量）决定微生物生长所需要水的下限值。

大多数细菌在水分活度0.91以下停止生长,大多数霉菌在水分活度0.8以下停止生长。

尽管有一些适合在干燥条件下生长的真菌可在水分活度为0.65左右生长,但一般把水分活度0.7～0.75作为微生物生长的下限。

9、无菌与灭菌、消毒与防腐的定义、概念

9.1无菌的定义：

ISO的定义为不含存活微生物的状态。

（注：

实际上关于不存在微生物的说明是无法证明的。

）

9.2灭菌的定义：

ISO的定义为用于使一个产品不含所有类型存活微生物的工艺。

注：

在一个灭菌过程中，微生物死亡性质可由一个指数函数描述。

因此，在任何个别物件上微生物的存在可以用概率来表示，这个概率可以减低至一个极低的数目，但不能降低至零。

9.3消毒的定义：

是指用物理的或化学的方法杀灭物体上的病原微生物，通常只杀死细菌的繁殖体。

9.4防腐的定义：

是指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。

9.5无菌的一些概念：

无菌：

是完全没有活的微生物存在；在实际应用中的含义是当使用生长培养基实验时，无任何细菌生长。

灭菌后的物品所处的状态即为无菌状态。

无菌操作：

是防止微生物污染机体和其他物品的操作技术。

无菌制药工艺：

则是防止微生物污染所进行药品生产的工艺。

灭菌是达到无菌状态的一种方法或一个过程。

9.6灭菌的概念

灭菌：

是用物理的方法（如加热、辐射、过滤）或化学的方法（如臭氧、环氧乙烷、灭菌剂、抗生素等）杀灭物体上的一切微生物的方法。

灭菌制药工艺：

是用物理的方法（如加热、辐射、过滤）或化学的方法（如臭氧、环氧乙烷、灭菌剂等）杀灭药品生产过程中物体上的一切微生物的工艺。

灭菌剂定义：

为杀灭在没有其他生命环境内的所有微生物生命形态的一种化学试剂。

无菌制药工艺与灭菌制药工艺的区别：

无菌制药工艺是用于生产不能最终灭菌的药品，灭菌制药工艺是用于生产最终灭菌的药品。

9.7消毒的概念

消毒：

用物理的或化学的方法杀灭物体上的病原微生物，称为消毒。

通常只杀死细菌的繁殖体。

常规的化学消毒剂的使用稀释液不具有杀灭孢子的能力。

消毒剂：

是指杀灭病原微生物的化学药物。

一种理想的消毒剂要具有以下几个特点：

（1）广谱高效地杀灭微生物；

（2）对人体无害；（3）无腐蚀性，对设备、物料、产品无污染；

（4）有洗涤剂作用；（5）在有效抗菌浓度时，易溶或混溶于水，与其他消毒剂无配伍禁忌

（6）具有较好的稳定性；（7）作用迅速；（8）不因有机物的存在而失去活性；（9）产生所期望的后效作用；（10）廉价。

不同的消毒剂在实际应用中都各有不同的优点和局限性。

可根据药品生产的要求，选择可以轮番使用的经过验证的几种消毒剂。

消毒剂品种应定期更换，防止产生耐药菌株。

（因微生物具有适应强、易变异的特性）

9.8防腐的概念

防腐：

是指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。

防腐剂：

是指能防止或抑制微生物生长繁殖的化学物质。

消毒剂和防腐剂没有本质区别。

一种化学物质在高浓度下是消毒剂，在低浓度下就是防腐剂。

一般可称为消毒（防腐）剂。

总之，对上述的术语定义要弄清楚，防止概念的混淆，区分它们之间存在的区别。

如，消毒与防腐，区别在浓度上和程度上；无菌和灭菌，区别在时态上；消毒与灭菌，区别在对象上，但有时又连用，如消毒灭菌方法，消毒是杀灭物体上的病原微生物，灭菌是杀灭物体上一切微生物。

10、灭菌方法概述

灭菌方法：

是指应用物理或化学等方法杀灭或除去一切存活的微生物增殖体或芽孢，使之达到无菌的方法。

灭菌法的简要分类：

物理灭菌法：

机理：

加热或射线灭菌可破坏蛋白质与核酸的氢键,导致蛋白质变性或凝固、核酸破坏，酶失活，从而使微生物死亡。

过滤除菌是一种机械截留。

（1）湿热灭菌法：

包括热压灭菌法、流通蒸汽灭菌法、煮沸灭菌法、低温间歇灭菌法。

（2）干热灭菌法；（3）紫外线灭菌法；（4）过滤除菌法；（5）微波灭菌法；（6）辐射灭菌法

化学灭菌法：

定义：

是指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法，同时不应损害制品的质量。

（1）气体灭菌法：

包括臭氧灭菌法、环氧乙烷灭菌法、甲醛灭菌以及其他气体灭菌（如,丙二醇和乳酸）。

（2）化学杀菌剂（或药液灭菌法）：

如0.1%-0.2%苯扎溴銨（新洁尔灭）溶液、2%酚溶液或煤酚皂溶液、75%酒精等。

10.1湿热灭菌

湿热灭菌法：

是利用饱和水蒸汽或流通水蒸汽进行灭菌的方法。

ISO定义为：

采用湿热以生产灭菌产品的工艺。

湿热是由水所产生的热，可以为液体或压力下的蒸汽。

高温是最可靠而普遍应用的灭菌法，高温可以使微生物蛋白质变性凝固，或破坏细胞膜的结构而使微生物死亡。

湿热灭菌比干热灭菌好,其主要原因是水蒸汽的比热远比干热空气大，且穿透力强,在水分存在情况下菌体蛋白质更易变性凝固。

此外，由于水蒸汽遇到较低温度的被灭菌的物体立即凝结成水，放出潜热，致使温度升高效力增加。

影响湿热灭菌的因素：

蒸汽的性质、消毒灭菌的产品（注射液）的性质、灭菌的时间、微生物的种类和数量等。

（1）蒸汽的性质

蒸汽有以下三种情况存在：

饱和蒸汽：

其温度与水的沸点相当，当蒸汽的压力达到平衡时，蒸汽中不含有细微水滴，此时的蒸汽含热量高，热的穿透力大，灭菌效果最高。

湿饱和蒸汽：

即饱和蒸汽中含有水滴，此种水蒸汽含热量低、热的穿透力差，因此灭菌效果也差。

过热蒸汽：

若热灭菌压器中水量不足，当液态的水全部蒸发后继续加热即生成过热蒸汽。

此时蒸汽与干热状态相似，在压力不变而继续加热时，温度虽高，但热的穿透力差，而又未达到干热灭菌所需的温度，因此灭菌效果也差，不及饱和蒸汽。

（2）接受灭菌的产品（如注射液）的性质：

含有营养物质如糖类、蛋白质类等，对微生物可能有一定保护作用，故能增强其抗热性能。

药液的pH值对微生物的活性也有较大的影响，耐热性能：

中性溶液中最强，碱性次之，酸性最不利微生物生长。

（3）灭菌时间：

灭菌温度越高灭菌时间越短。

但应根据被灭菌物的稳定性，应在达到有效灭菌的前提下尽可能降低灭菌温度或缩短灭菌时间。

（4）微生物的种类：

各种微生物对热的抵抗力不同，同一种类在不同发育阶段的微生物对热的抵抗力也不同。

增殖期的微生物对热抵抗力比衰老期小得多。

同一温度下，微生物增殖体和芽孢的数量越多，其中出现耐热个体的机会越多，并使灭菌后的微生物尸体增多。

为了有效地灭菌,必须有水蒸汽和较高的温度,饱和蒸汽的比干热空气及过热水蒸汽的穿透力强得多。

一般进行湿热灭菌使用1.0kg/cm2的饱和水蒸汽，其温度为121℃。

此时，饱和水蒸汽提供的有效的热量是相同的温度的空气的7倍以上。

10.1.1热压灭菌法：

是湿热灭菌技术中最常用的方法。

热压灭菌法是在密闭的容器中利用高压的饱和水蒸汽进行的灭菌。

此法灭菌作用强。

适用于不受高温高压湿气影响的物料的灭菌。

在常规情况下，用115.5℃即表压0.7kg/cm2时加热30min，即能杀死所有微生物增殖体和芽孢。

灭菌的温度、压力与时间如下表

温度

压力

时间

115℃

121.5℃

126.5℃

6.68×104Pa（10磅）

9.81×104Pa（15磅）

13.72×104Pa（20磅）

30min

20min

10min

使用热压灭菌器时应注意：

（1）将灭菌器的空气排尽。

若灭菌器内有空气在，则压力表上所指示的压力，是灭菌器内蒸汽和空气二者的总压而非单纯的水蒸汽压力，结果压力表所指示的压力达到了，但温度却未达到，所以不能产生应有的灭菌效果。

同时，由于空气携带热气低于蒸汽，穿透力也差，致使灭菌效能降低。

（2）灭菌时间必须是从全部内容物均已达到规定温度时开始计算，故测定预热时间和尽量缩短升温时间，具有重要意义。

（3）避免压力聚然下降。

灭菌完毕后，停止加热，使灭菌器内的温度和压力逐渐下降。

（主要是要注意安全）

（4）注意灭菌器的防锈和除锈，保持各种管路畅通。

10.1.2流通蒸汽灭菌法：

是在不密闭的容器内用蒸汽灭菌的方法。

10.1.3煮沸灭菌法：

是将灭菌物放入水中煮沸30-60min进行灭菌的方法。

高原地区由于水的沸点降低，应适当延长灭菌时间或在水中加入1%-2%碳酸钠或适量食盐以提高水的沸点。

此法不能杀灭所有芽孢。

10.1.4低温间歇灭菌法系将灭菌物品于80℃加热1小时后，在20-25℃保持24小时，使芽孢发育成增殖体后，再第二次加热时被杀灭，如此连续操作三次以上。

此法所需时间长，效果并不可靠，仅用于遇高温极易破坏，且本身有抑菌作用或添加抑菌剂的物料。

凡用此法灭菌的注射剂不得用于静脉注射和椎管注射。

10.1.5水浴式灭菌法

水浴式灭菌法是目前国内外采用的较为先进的方法。

其灭菌方式是采用以去离子水为载热介质，用加热介质去加热输液瓶内的药液，并通过高温将药液中的微生物杀灭。

10.1.6巴氏消毒法此法因巴斯德首创而得名，是一种较低温度消毒法。

虽然嗜热微生物在此温度下可能免于一死，但它们在人体体温条件下不能生长，主要针对牛奶中的的病原菌如结核杆菌和沙门氏菌，在巴氏消毒条件下它们均被杀死。

其方法可分两类：

低温维持法，即63℃下维持30分钟；高温瞬间法，即72℃下维持15秒。

10.2干热灭菌法：

利用火焰或干热空气进行灭菌的方法

干热空气灭菌法：

干热空气的穿透力弱且不均匀，空气的比热低，是不良的传热物质。

与湿热灭菌相比，干热灭菌需要较高的温度（140－170℃）和较长的时间（2-3小时），才能达到灭菌的目的。

灭菌时间必须从灭菌物品全部达到该温度时开始计算。

被灭菌物料上的细菌，主要是通过提高了的温度使细胞成分产生非特异性氧化而被破坏（细胞固有的水分也起了重要作用），高温干热可使微生物的酶受热变性、细胞内的核糖核酸破坏以及细胞膜受损伤而死亡；细胞被破坏的过程是可预测的和可靠的。

此法适用于耐高温的玻璃、金属或陶瓷制品以及不允许湿气穿透的油脂类药物和耐高温药物的灭菌。

不适用于橡胶、塑料制品和大部分药品。

需灭菌物品在灭菌前必须用适当的包皮包裹，或置于密闭的容器中可使灭菌完毕仍能保持无菌状态。

滑石粉等可采用干