高考选修考点五基因工程.docx

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高考选修考点五基因工程

考点五：

基因工程

基础知识

、基因工程的含义与工具

1.基因工程与遗传工程:

基因工程是狭义的遗传工程。

广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去,并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。

2.基因工程的核心是:

构建重组DNA分子。

3.基因工程的工具

（1）限制性核酸内切酶

a.来源:

主要是从微生物（如细菌）中分离纯化出来的。

b.功能:

识别并切开每条链中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。

c.特点:

具有专一性,表现在以下两个方面:

识别DNA分子中某种特定的核苷酸序列;使每一条链中特定位点的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

d.作用结果:

产生粘性末端或平末端。

（2）DNA连接酶功能:

将末端碱基互补的2个DNA片段连接起来。

（3）载体a.最常用的载体——质粒实质:

是能够自主复制的双链环状DNA分子,是一种特殊的遗传物质,在细菌中以独立于拟核之外的方式存在。

b.其他载体:

噬菌体、植物病毒和动物病毒等。

二、基因工程基本操作步骤

1.基因工程基本操作“五步曲”

（1）获得目的基因序列未知:

建立一个包括目的基因在内的基因文库,再从基因文库中获取。

序列已知:

化学方法（如逆转录法）合成或者用PCR扩增目的基因。

PCR技术与DNA复制的比较

PCR技术

DNA复制

相同点

原理

DNA双链复制（碱基互补配对）

原料

四种游离的脱氧核苷酸

条件

模板、酶、能量等

不同点

解旋方式

DNA在高温下变性解旋

解旋酶催化

场所

体外复制

主要在细胞核内

酶

热稳定的DNA聚合酶

细胞内含有的DNA聚合酶

结果

在短时间内形成大量的DNA片段

形成整个DNA分子

（2）形成重组DNA分子

一般采用同种限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因,以获得相同的粘性末端（或平末端）,以

利于形成重组DNA分子,但有时用不同的限制性核酸内切酶处理也可以获得相同的粘性末端（或平末端）。

目的基因的插入可能会破坏转基因生物原有基因的结构,影响转基因

生物的正常生长,甚至致死。

限制性核酸内切酶只识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列,对RNA不起作用。

用DNA连接酶连接时,可形成3种不同的连接物:

目的基因—载体连接物、载体—载体连接

物、目的基因—目的基因连接物,导入受体细胞后,可利用抗性基因的差异进行筛选。

（3）将重组DNA分子导入受体细胞

生物种类

植物细胞

动物细胞

微生物细胞

常用方法

农杆菌转化法

显微注射技术

2+

Ca2+处理法

受体细胞

体细胞

受精卵

原核细胞

转化过程

将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→目的基因稳定维持和表达

将重组DNA分子提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物

2+

用Ca2+处理细胞使之成为感受态细胞→重组DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收重组DNA分子

（4）筛选含有目的基因的受体细胞

原理:

质粒上有抗生素抗性基因等标记基因。

方法:

利用选择培养基筛选。

举例:

所有受体细胞?

含四环素培养基?

活的受体细胞

?

?

重组DNA分子含重组DNA分子的受体细胞

（质粒上有四环素抗性基因）

在实际应用中还有:

a.检测是否插入目的基因,利用DNA分子杂交技术,目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交,看是否有杂交带。

b.检测是否转录出了mRNA,利用核酸分子杂交技术,目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交,看是否有杂交带。

（5）目的基因的表达:

看到目的性状或分离到目的基因表达产物

检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。

个体生物学水平的鉴定:

如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

2.有关基因工程操作易错分析

（1）基因文库中的基因保存在受体菌中。

（2）原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,有利于目的基因的复制与表达,因此常

采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。

（3）植物细胞的全能性较高,可经植物组织培养过程成为完整植物体,因

此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞;动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。

（4）操作工具有三种,但常用工具酶有两种,载体不是酶;在基因工程操作步骤“获得目的基因”和“形成重组DNA分子”两个过程中通常用同种限制酶,目的是产生相同的粘性末端（或平末端）;DNA连接酶只在“形成重组DNA分子”操作中用到。

（5）一般情况下,用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段,但有时可

用两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和目的基因,这样可避免质粒和质粒之间、目的基因

和目的基因之间的连接。

（6）标记基因的种类和作用:

标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞,常见

的有抗生素抗性基因、发光基因（表达产物为

带颜色的物质）等。

三、基因工程与遗传育种

1.转基因植物

a.所需时间较短

培育优点?

培育优点?

b.克服远缘亲本?

　难以杂交的　缺陷

2.转基因动物

（1）含义:

转入了外源基因的动物。

（2）培育优点:

省时、省力。

四、基因工程与疾病治疗

1.基因工程药物

名称

成分

用途

传统方法

基因工程方法

胰岛素

蛋白质

治疗胰岛素依赖

型糖尿病

从猪和羊的胰腺中

提取

通过大肠杆菌生产

干扰素

?

糖蛋白

治疗病毒性肝炎

从人血液中提取

通过基因工程,使人白细胞

和肿瘤

干扰素基因获得克隆和表

达

乙型肝

预防乙

通过基因工程利用酵母菌

蛋白质

炎疫苗

型肝炎

和哺乳动物细胞生产

2.基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因,以纠正或补偿基因的缺陷,达到治疗的

目的。

五、基因工程与生态环境保护

1.利用转基因植物生产聚羟基烷酯,用于合成可降解的新型塑料。

2.改造分解石油的细菌,提高其分解石油的能力。

3.利用转基因微生物吸收环境中的重金属、降解有毒化合物和处理工业废水。

重点难点

、基因工程的三大操作工具

1.限制性核酸内切酶

（1）限制性核酸内切酶（限制酶）的作用限制酶切割时断开的是DNA分子中的磷酸二酯键（即相邻脱氧核苷酸间的键）,而不是两条链之间的氢键。

如图

（2）限制性核酸内切酶具有专一性,表现在两个方面识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。

切割特定序列中的特定位点。

如图:

2.DNA连接酶

（1）DNA连接酶的作用

两个来源不同的DNA用相同的限制性核酸内切酶切割

形成相同的粘性末端（或平末端）。

DNA连接酶能催化磷酸与脱氧核糖之间化学键的

形成,将两个DNA末端的缝隙“缝合”起来。

如图:

（2）几种易混淆酶的比较

名称

功能

应用

限制酶

特异性地切断DNA链中的磷酸二酯键

重组DNA技术

DNA连接酶

连接DNA片段之间的磷酸二酯键

基因工程

DNA聚合酶

连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键

DNA复制

RNA聚合酶

连接RNA片段与单个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键

RNA复制和转录

逆转录酶

作用于磷酸二酯键

以RNA为模板获得

DNA

DNA解旋酶

使碱基对之间的氢键断裂

DNA复制

DNA水解酶

使DNA分子所有磷酸二酯键断裂

水解DNA

3.载体的种类及作用

（1）载体应具备的特征能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。

有1个或多个限制性核酸内切酶切点,以便与外源基因连接。

具有某些标记基因,以便进行筛选。

（2）载体的种类

细菌质粒,最常用大肠杆菌质粒或噬菌体和某些动植物病毒。

一般来说天然的载体往往不能满足人们的所有要求,因此人们根据不同目的和需求,对某些天

然的载体进行人工改建。

（3）作用

一是用它作为运载工具,将目的基因送到宿主细胞中去;二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

、基因诊断与基因治疗

1.基因诊断

（1）方法:

DNA分子杂交法（即DNA探针法）,该方法是根据碱基互补配对原则,把互补的双链DNA解开,把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记,之后同

被检测的DNA中的同源互补序列杂交,从而检出所要查明的DNA或基因。

（2）步骤:

抽取病人的组织或体液作为化验样品;将样品中的DNA分离出来;用化学法或热处理

法使样品DNA解旋;将事先制作好的DNA探针引入化验样品中,这些已知的经过标记的探针若能够在化验样品中找到互补链,则与之结合（杂交）在一起,找不到互补链的DNA探针,则可以被洗脱。

这样通过对遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析,就能检出病人所得的病。

2.基因治疗

（1）原理:

利用正常基因纠正或补偿基因的缺陷,即把正常基因导入患者体内,使该基因的表达

产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的,而原有缺陷基因一般不做处理。

（2）方法:

有体外基因治疗和体内基因治疗,体外基因治疗方法疗效较好。

如重度免疫缺陷症的体外基因治疗方法:

方法：

限制性核酸内切酶和DNA连接酶作用分析

1.限制酶

限制酶具有专一性,表现在两个方面:

（1）识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。

识别序列的特点:

呈现碱基互补对称,无论是奇

数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中轴线,如图,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是

反向对称重复排列的。

如:

以中心线为轴,两侧碱基互补对称;

为轴,两侧碱基互补对称。

（2）切割特定序列中的特定位点,使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

产生的DNA片段末端通常有两种形式——粘性末端和平末端。

a.粘性末端:

当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时,产生的是粘

性末端。

如:

EcoRⅠ识别GAATTC序列,将G与A之间的磷酸二酯键切开。

如图所示

b.平末端:

当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时,产生的则是平末端。

如:

SmaⅠ识别CCCGGG序列,将C与G之间的磷酸二酯键切开。

如图所示

[知能拓展]

（1）限制酶具有专一性,一般情况下,不同限制酶切割形成的粘性末端（或平末端）不同。

但也有

用不同限制酶处理后形成的粘性末端（或平末端）相同,可以用DNA连接酶进行连接。

如

G↓GATCC和↓GATC限制酶识别的序列不同,但处理后形成的末端相同。

（2）一般情况下,用同一种限制酶分别处理质粒和目的基因,使其具有相同的粘性末端（或平末

端）。

但如果都用相同的两种限制酶分别处理,也可形成分别对应的相同粘性末端（或平末端）,

例如目的基因的两端分别有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点,质粒上也有这两种酶的切点。

如

2.限制酶选择的注意事项

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。

为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒

如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。

（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的粘性末端（或平末端）。

质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限

制酶SmaⅠ会破坏标记基因;如果所选酶的切点不是一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。