抗心磷脂抗体应用手册.docx
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抗心磷脂抗体应用手册
抗心磷脂抗体应用
——技术应用手册
第一章磷脂抗体和凝血基础知识3
1.1抗磷脂抗体及其相关疾病3
1.2凝血机制3
1.3APL与血栓形成4
第二章磷脂抗体相关疾病5
2.1抗磷脂综合征5
2.2、APL与脑血管疾病6
2.3、APL与异常妊娠7
2.4、APL与其他相关疾病8
第三章磷脂抗体及其检测9
3.1、磷脂抗体主要检验项目9
3.2APL抗体阳性率9
3.3APL抗体检测现状与建议10
3.4、磷脂抗体重点关注人群12
第一章磷脂抗体和凝血基础知识
1.1抗磷脂抗体及其相关疾病
抗磷脂抗体（anti-phospholipidantibodies,APL）是一类异质程度很高的自身抗体，主要以血浆中与带负电的磷脂相结合的蛋白质为靶抗原。
与临床关系最为密切的APL主要包括：
狼疮抗凝物（lupusanticoagulant,LA）、抗心磷脂抗体（anti-cardiolipin,aCL）、抗β2糖蛋白1（anti-β2-glycoprotein1,anti-β2-GP1）抗体和抗磷脂酰丝氨酸抗体（anti-phosphatidylserine,aPS）。
APL是血栓性疾病发病的独立风险因子。
APL通过活化内皮细胞、单核细胞和血小板，使机体处于高凝状态，容易形成血栓。
目前有大量的回溯性实验和前瞻性流行病学研究表明，APL在不同程度上提示血栓相关的心脑血管疾病、病态妊娠以及抗磷脂综合征（APS）、系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫疾病的发病风险。
APL的常规筛查应用在心血管、神经、血液、呼吸、妇产、内分泌等科室，对于疾病诊断、风险提示和疾病预防以及治疗方案的选择上均具有重要意义。
甚至在普通人群健康体检中对心脑血管的预警也有巨大价值。
1.2凝血机制
血液凝固是由凝血因子按一定顺序相继激活而成的凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白的过程。
凝血酶原酶复合物可通过内源性凝血途径和外源性凝血途径生成。
（1）内源性凝血途径：
是指参与凝血的因子全部来自血液，通常因血液与带负电荷的异物表面（玻璃、白陶土、胶原、某些脂类）接触而启动的凝血过程。
血液与带负电和的异物表面接触时，首先是凝血因子FXII结合到异物表面，被激活成FXIIa。
FXIIa再激活FXI，FXIa在Ca2+存在下，激活FIX。
FIXa在Ca2+作用下与FVIIa在活化的血小板提供的膜磷脂表面结合成复合物可进一步激活FX为FXa，从而启动内源性凝血途径。
（2）外源性凝血途径：
由来自于血液之外的组织因子（TF，一种跨膜蛋白，存在于大多数组织细胞），暴露于血液而启动的凝血过程，又称组织因子途径。
血管损伤时，暴露出TF，TF与FVIIa结合形成复合物催化两个重要反应：
a.激活FX成为FXa。
b.激活FXI成为FXIa。
这样使得外源性途径与内源性途径相互联系，相互促进，共同完成凝血过程。
由内源性和外源性凝血途径所生成的FXa，在Ca2+存在的情况下可与FVa在磷脂膜表现形成FXa-FVa-Ca2+-复合物，即凝血酶原复合物，进而激活凝血酶原。
凝血酶原在凝血酶复合物的作用下激活成为凝血酶。
凝血酶的功能是：
使纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，再形成不溶于水的交联纤维蛋白多聚体凝块；使血小板活化，为因子X酶复合物和凝血酶原酶复合物的形成提供有效的磷脂表面。
1.3APL与血栓形成
易栓症（Thrombophilia）是指存在抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等遗传性或获得性缺陷，或者存在获得性危险因素而具有高血栓栓塞倾向。
人体中的凝血酶调节蛋白（TM）的功能和构象的维持依赖于负电荷磷脂的参与，有研究证实，APL和TM之间存在交叉反应可以使TM在内皮细胞表面表达下降，导致血栓的形成。
APL通过与负电荷磷脂结合，从而改变TM的活性，干扰了蛋白C的活化。
β2-GP1的第5结构域和细胞膜上的负电荷磷脂结合后发生构象变化，暴露出1区和2区的抗原表位即可被APL识别，结合形成复合物参与血栓形成。
抗心磷脂抗体（ACL）与磷脂酰丝氨酸的交叉反应，使之与血小板结合并激活血小板，也可引起血栓形成。
其他可能的机理还包括血小板合成的血栓素增加，抑制前列腺环素的合成，以及刺激由内皮细胞产生组织因子。
图APL与血栓形成的关系示意图
第二章磷脂抗体相关疾病
2.1抗磷脂综合征
抗磷脂综合征（APS）为一种以反复动脉或者静脉血栓、病态妊娠和抗磷脂抗体（APL）持续阳性的疾患。
APS可继发于系统性红斑狼疮或者其他自身免疫病，但也可单独出现（原发APS）。
无论原发或者继发的APS，其临床表现及实验室检查并无差别。
女性发病率明显多于男性。
表12006年悉尼国际APS会议修订的分类标准
诊断APS必须具备下列至少l项临床标准和l项实验室标准
项目
标准详述
临床标准
血管栓塞
任何器官或组织发生1次以上一的动脉、静脉或小血管血栓a，血栓必须被客观的影像学或组织学证实。
组织学还必须证实血管壁附有血栓，但没有显著炎症反应
病态妊娠
①发生1次以上的在l0周或10周以上不可解释的形态学正常的死胎，正常形态学的依据必须被超声或被直接检查所证实。
②在妊娠34周之前因严重的子病或先兆子痫或严重的胎盘功能不全所致1次以上的形态学正常的新生儿早产。
③在妊娠10周以前发生3次以上的不可解释的自发性流产．必须排除母亲解剖、激素异常及双亲染色体异常
实验室标
血浆中出现LA，至少发现2次，每次间隔至少12周
用标准ELISA在血清中检测到中-高滴度的lgG/IgM类aCL抗体（IgG型aCL>40GPL；lgM型aCL>40 MPL；或滴度>99的百分位数）；至少2次。
间隔至少12周
用标准EuSA在血清中检测到IgG／lgM型抗β2-GP1抗体，至少2次．间隔至少12周（滴度>99的百分位数）
注：
·APS的诊断应避免临床表现和aPL阳性之问的间隔<12周或>5年。
当共存遗传性或获得性引起血栓的因素时也能诊断APS，但应注明（A）存在；（B）不存在其他引起血栓的因素。
危险因素包括：
年龄（男性>55岁，女性>65岁）；存在已知的心血管危险因素（如高血压、糖尿病、低密度脂蛋白升高、高密度脂蛋白降低、胆固醇降低、吸烟、心血管病早发的家族史、体质量指数≥30kg／m2、微量门蛋白尿、肾小球滤过率<60ml／min）、遗传性血栓倾向、口服避孕药、肾病，恶性肿瘤、卧床和外科手术。
因此，符合APS分类标准的患者应该按照血栓发生的原因分层。
2012年发表在Arthritis&Rheumatism杂志上关于APS实验室诊断标准的国际共识指南建议，当LA、aCL抗体IgM/IgG（aCL<12PL-Ig*-U/ml）以及抗β2-GP1抗体IgM/IgG（β2-GP1<20RU/ml）均为阴性，但是临床仍高度怀疑APS时建议增加aCL和抗β2-GP1抗体的IgA检测。
如果所有指标阴性，检测aPS抗体的IgG/IgM/IgA亚型（阳性：
aPS≥12RU/ml），有助于APS疑似患者的诊断。
2.2、APL与脑血管疾病
许多研究表明，APL和血栓的形成有密切相关性，是导致各类血栓发生的高风险因素。
APL造成血栓和栓塞可以发生在任何血管床，以静脉血栓或栓塞最为常见，如果血栓发生在动脉，则中枢神经系统最容易受累，常表现为中风或一过性脑缺血发作。
据报道，抗ß2-GP1抗体IgA与aPS抗体IgG是缺血性中风的重要风险因素。
在神经系统中，APL阳性除了与偏头痛、休克、短暂性脑缺血等抗磷脂综合征的症状相关外，该指标可作为脑梗塞发作及复发的预测指标。
在美国心脏协会/美国中风协会（AHA/ASA）的临床医师指南中，APL被认定为脑梗塞的风险因子之一。
中国人群的研究显示aCL抗体和血栓性脑梗死密切相关，在131例脑梗死患者中，年龄在34岁以下的12例患者aCL抗体均阳性（≥12PL-Ig*-U/ml）。
同时还发现，多灶梗死的aCL抗体阳性率为50.9%，较单灶梗死的阳性率明显增高。
表2APS相关的血栓表现
血管
累及血管
临床表现
静脉
肢体
深静脉血栓
脑
中枢静脉窦血栓
肝脏（小静脉）
肝肿大；转氨酶升高
肝脏（大静脉）
Budd-chiari综合征
肾脏
中央静脉血栓；出血、梗死、艾迪生病
肺
肺血管栓塞、毛细血管炎；肺出血；肺动脉高压
大静脉
上/下腔静脉综合征
皮肤
网状青斑；皮下结节；
眼
视网膜静脉血栓
动脉
肢体
缺血性坏死
脑（大血管）
脑卒中；短暂性脑缺血发作；Sned-don综合征
脑（小血管）
急性缺血性脑病；多发性脑梗死性痴呆
心脏（大血管）
心肌梗死；静脉搭桥后再狭窄
心脏（小血管-急性）
循环衰竭；心脏停搏
心脏（小血管-慢性）
心肌肥厚；心律失常；心动过缓
肾脏（大血管）
肾动脉血栓；肾梗死
肾脏（小血管）
肾血栓性微血管病
肝脏（肝梗死）
主动脉（主动脉弓）
主动脉弓综合征
主动脉（腹主动脉）
附壁血栓
皮肤
指端坏疽
眼
视网膜动脉和小动脉血栓
2.3、APL与异常妊娠
正常情况下，孕妇会保证胎儿的血液供给，抑制子宫和胎盘的血栓形成。
血循环不良是导致着床失败、早期流产和反复流产的首要因素，在不明原因的胎停患者中，约2/3的女性是易栓体质。
目前认为，APL通过作用于胎盘血管内皮细胞的膜磷脂，使前列环素（PGI2）合成释放减少，干扰血栓调解素及纤维蛋白溶酶原激活剂的释放，影响蛋白质C系统的活化，导致凝血功能亢进，改变血小板和血管内皮关系等多种病理机制，造成血栓形成和滋养层细胞功能改变，引起子宫内膜蜕膜、胎盘供血不足形成反复流产、死胎、早产等从而导致妇女不育。
APLs作为病态妊娠的高风险因素，与产科中很多病症相关，如先兆子痫、妊高症、习惯性流产、早产、宫内生长迟缓和宫内死胎或死产等。
反复流产的高危险因素
两次或两次以上自然流产的发生率为5%。
在已知原因中，自身免疫（如抗磷脂综合症）导致的反复流产比例最高。
反复流产妇女中APLs阳性率（20%）远远高于正常产妇（5%）。
中国人群的研究显示，aCL抗体、抗β2-GP1抗体滴度的升高是导致复发性流产的原因。
先兆子痫、妊高症的高危险因素
先兆子痫主要与抗磷脂综合症相关，11%-17%先兆子痫患者表达APLs，且最常见于孕34周以下的严重先兆子痫。
抗β2-GP1抗体IgG和IgM在先兆子痫及严重先兆子痫患者中的阳性率均明显高于正常孕妇，提示抗β2-GP1抗体阳性时，发生先兆子痫的风险较高。
早产的高危险因素
研究者对1155名孕妇进行多种APLs检测，发现抗体阳性组的早产率显著高于阴性组。
数据显示，任一种APLs阳性的孕妇早产率为17%，比阴性组高一倍。
尤为显著的是aCL抗体IgG和IgM阳性组的早产发生率分别为23%和7.7%，比阴性对照组高6倍以上（3.5%和1.2%）。
其他病态妊娠的高危险因素
aCL抗体阳性的孕妇发生宫内死胎或死产和宫内生长迟缓的相对风险非常高。
研究证实，aCL抗体阳性组和阴性组的宫内死亡率分别为25%和0.5%，差异极为显著；原因不明胎儿宫内生长迟缓的发生率为11.7%，明显高于阴性组的1.9%。
APLs是孕妇预防治疗的提示指标
对于APLs阳性的孕妇，美国心脏协会/美国中风协会（AHA/ASA）推荐使用低分子量肝素和低剂量的阿司匹林。
高风险APLs阳性的妇女和发生过脑梗塞或严重动脉血栓的妇女，要考虑在孕14-34周使用华法林。
另外,对于aCL抗体阳性所致复发性流产，大多用免疫抑制剂和抗凝剂治疗以获得良好的妊娠结果。
2.4、APL与其他相关疾病
APL引发的APS相关肾病主要表现为肾动脉血栓／狭窄、肾脏缺血坏死、肾性高血压、肾静脉的血栓、微血管的闭塞性肾病和相关的终末期肾病。
另有80％的APS患者有网状青斑，心脏瓣膜病变是晚期出现的临床表现，严重者需要做瓣膜置换术。
此外，APS相关的神经精神症状包括偏头痛、舞蹈病、癫痫、吉兰一巴雷综合征、一过性球麻痹等，缺血性骨坏死极少见。
第三章磷脂抗体及其检测
3.1、磷脂抗体主要检验项目
3.1.1抗心磷脂抗体（aCL）
抗心磷脂抗体（aCL）与APS的关系较为密切，aCL检测是了解疾病进展及是否伴发APS的实验室指标，且高水平的IgG型aCL对原发性抗磷脂综合征的诊断最为特异。
另外，aCL阳性或持续升高与患者动、静脉血栓形成，血小板减少，反复自发性流产及神经系统损伤为特征的多系统受累的APS相关。
aCL水平越高，越容易发生并发症，且aCL类型、水平、亲和力、结合的特异性以及环境遗传因素等可能与并发症是否容易发生相关。
aCL测定最常用ELISA方法，也可见化学发光法。
由于实验室及试剂来源不同，aCL测定结果的特异性和敏感性也不同，结果波动大，国际社会虽不断努力，但是aCL检测结果实验室之间还是很难达到一致。
所以aCL阴性也不能完全排除抗磷脂抗体存在的可能性。
3.1.2狼疮抗凝物（LA）
狼疮样抗凝物（LA）分为筛选试验和确证试验。
筛选试验的血浆凝固时间延长，可见于血中存在LA、先天性FX或FV或FII缺乏症、口服抗凝药、肝素治疗及弥散性血管内凝血等。
当筛选试验时间延长时，还需做确证试验，确证试验试剂中多了些磷脂成分以中和LA，使延长的时间得以纠正，说明筛选试验的血浆凝固时间延长是由LA引起，所以通过LA测定可以确定APS是否由LA所致。
但是LA阴性不能完全排除aCL存在的可能性，尤其在急性血栓发作时，抗体可以一过性消耗而降至正常。
APS患者可检出LA存在2次或者2次以上（间隔至少6周）LA阳性，可作为APS诊断标准之一。
LA在正常人群阳性率是3.6%，甚至更低，在SLE患者中阳性率10%-50%。
3.1.3抗β2糖蛋白1抗体（β2-GP1）
APS患者常检出抗β2糖蛋白1抗体，高滴度β2-GP1抗体与APS相关。
β2-GP1抗体不仅是检测SLE和APS磷脂抗体必须的辅助因子，其自身本来就是这些疾病中自身靶抗原，SLE和APS患者β2-GP1的检测，比传统的磷脂抗体有更好的诊断价值。
3.2APL抗体阳性率
APL抗体可分为IgG、IgM和IgA型，以IgG型最为常见，Ig M型次之，IgA型APL抗体与自身免疫性疾病的关系较小。
30-40%的SLE患者的APL阳性，但只有其中的1/3发展成为APS。
LA和aCL与年龄、病程、SLE的临床表现（如多发性关节炎、胸膜炎、浆膜炎）等皆无关系。
30%以上的的SLE患者接受抗凝治疗仍有APL阳性。
APL在类风湿患者中阳性率可达33%-49%。
表3APL抗体阳性率
疾病
抗体阳性率%
aCLIgG
aCLIgM
aCLIgA
β2-GP1IgG
β2-GP1IgM
β2-GP1IgA
SLE
50-60
40-50
10-20
——
——
——
反复流产
41.1
15.7
12.7
9
15.6-57.7
10-36
表4磷脂综合征患者中相关抗体的阳性率
靶抗原
阳性率%
磷脂（心磷脂等）标志性抗体
86
β2糖蛋白1抗体
54
狼疮样抗凝物标志性抗体
75
需要注意的是磷脂抗体的出现并不一定发生血栓，约12％的健康人中可以出现IgG或IgM类aCL抗体阳性。
梅毒和艾滋病、Lyme病、传染性单核细胞增多症、结核等疾病分别有93％、39％、20％、20％的aPL阳性率。
一些药物如酚噻嗪、普鲁卡因酰胺、氯丙嗪、肼苯达嗪、苯妥英钠、奎宁、普萘洛尔和口服避孕药也可以诱导出磷脂抗体；另外，有一些恶性肿瘤如黑色素瘤、肾母细胞癌、肺癌、淋巴瘤和白血病等亦可出现aCL或抗β2-GP1抗体阳性。
另外，对于磷脂抗体阳性阳性变化情况，有时由于患者发生急性血栓一过性消耗抗体，会导致抗体在短时间内由阳性转阴。
若患者近期内有溶栓治疗，也可能很快由阴性转为阳性。
3.3APL抗体检测现状与建议
在第13届抗磷脂抗体国际大会上，由该领域科学家组成的工作组讨论并分析了抗磷脂抗体（aPL）检测标准化相关的关键问题，并发表关于抗心磷脂抗体（aCL）和抗β2糖蛋白I抗体（抗β2GPI抗体）检测的最佳方案和技术要求的国际共识指南。
主要内容摘录如下：
检测前：
样本要求
●血清：
建议用无溶血和无脂样本，避免对样本热灭活（56℃、30分钟）。
●血浆：
厂商必须说明样本类型，包括所用抗凝剂。
使用血浆时应考虑抗凝剂所致的稀释作用。
样本中血小板含量应低于10000/μl。
检测中
aCL及抗β2GPI抗体亚型测定
●需要检测aCL及抗β2GPI抗体的IgM及IgG亚型。
●当其他检测均为阴性但仍怀疑为APS时，则推荐检测aCL和抗β2GPI抗体的IgA亚型。
抗原
●aCL：
应使用心磷脂+（牛或人）β2GPI。
●抗β2GPI：
应使用人源性β2GPI，测定时使用负电荷（高结合力或经γ-照射后）板。
结果定量
●aCL：
用IgG型磷脂/IgM型磷脂（GPL/MPL）单位表述aCL检测结果（1个GPL/MPL单位代表1 μg/ml亲和纯化的IgG或IgM aCL的心磷脂结合活性），并确立低、中和高度阳性的阈值。
●抗β2GPI抗体：
暂无通用的测定单位，推荐建立国际或通用测量单位。
标准
●鼓励厂商及检测人员选择可靠的标准品制备二次校准样本（多克隆或单克隆抗体）。
●二次校准样本须经过公认标准品的对比和验证。
●如有可能，使用一组患者血清进一步确定检验系统的一致性程度。
●更重要的是，标准品的生产和质控应遵从美国食品和药物管理局（FDA）药品生产和质量管理指南或与之相当的质量保证方案。
●从推荐标准到任何再次校准均应做到有据可查（即留有记录）。
标准曲线
●每次检测均应有标准曲线。
●须行多点校准，并采用统计学校正的拟合和计算方法。
●当检测读数与预期值之间的相关系数小于0.90，不能使用该标准曲线。
精确度
●酶联免疫吸附（ELISA）结果的变异系数（CV）应小于0.10。
●需多水平（包括低～中滴度阳性界值）评估精确度。
●对于商品化试剂盒，产品操作手册上应标明预期精度。
阳性/阴性对照
●每次测定至少需要一个阳性对照，以监测两次测量间的差异。
●理论上，阳性对照值应在试剂盒的低~中滴度界值范围内，以获得推荐的精度值。
●阳性对照值应在测定的线性范围内。
●同样，每次测定均需一个阴性对照，阴性对照值应低于界值。
●当阴性/阳性对照值落在设定范围外时，视本次测定无效。
单次/重复测定、界值计算
●若单次测定能获得满意的精确度，无须做重复测定。
●采用非参数百分比法确定界值。
●鼓励厂商根据第95和99百分位来确定和报告界值。
●临床实验室使用商业化试剂盒时须核对厂商提供的界值。
类风湿因子的干扰
●在评价时，应注意类风湿因子可影响测试结果。
检测后
检测报告
●结果应以单位或半定量范围进行报告，并标注阴性、“可疑”、中度阳性和高度阳性。
注释
●强烈建议在报告检测结果时，列入有助于临床医师的注释。
●生产商应公开源于临床研究的证据信息，这也许有助于结果的解释。
3.4、磷脂抗体重点关注人群
Ø所有发生自发性静脉血栓病变者；
Ø对于小于50岁的人群或没有其他明显危险因素的老年人，发生中风或者外周动脉血栓事件者；
ØSLE或其他自身免疫疾病并发血栓病变者；
Ø发福流产或伴有早产的妊娠并发症患者；
Ø不明原因的血小板减少患者。
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