甜柿三萜类物质的分离条件的优化研究.docx

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甜柿三萜类物质的分离条件的优化研究

学号:

本科生毕业论文（设计）

题目:

甜柿三萜类物质的分离条件的优化研究

作者姓名:

专业班级:

指导教师:

生命科学学院

二零一六年五月

郑重声明

本人的毕业论文（设计）是在老师的指导下独立撰写并完成的。

毕业论文（设计）没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此产生的各种后果，直至法律责任；并可通过网络受公众的查询，特此郑重声明！

毕业论文作者（签名）：

年月日

目录

摘要1

Abstrac.2

1前言3

1.1罗田甜柿简介3

1.1.1柿子的研究进展3

1.2三萜类化合物介绍3

1.2.1三萜类化合物的结构特点4

1.2.2三萜类化合物的生物合成4

1.2.3三萜类化合物提取方法4

1.2.4三萜类化合物的定量分析方法5

1.2.5三萜类化合物的生物活性6

1.3本课题研究的主要内容7

2材料与方法7

2.1实验材料7

2.2主要仪器与设备7

2.3材料的预处理7

2.4提取条件的研究8

2.4.1确定提取的溶剂种类的方法8

2.4.2确定提取时乙醇的浓度的方法8

2.4.3确定提取时间的方法8

2.4.4确定提取温度的方法8

2.4.5确定料液比的方法8

2.4.6确定最佳提取次数的方法8

2.5香草醛-冰乙酸、高氯酸显色法测定提取液中总三萜的含量8

3结果与分析9

3.1提取溶剂种类的确定9

3.2提取溶剂浓度的确定9

3.3提取时间的确定10

3.4提取温度的确定10

3.5提取料液比的确定11

3.6提取次数的确定12

4结论12

参考文献14

致谢15

甜柿三萜类物质的分离条件的优化研究

摘要：

为确定罗田甜柿果肉中三萜类物质提取最佳工艺条件，将湖北省罗田三里畈镇的罗田甜柿作为实验材料，在单因素试验基础上，以三萜类物质的提取率为指标,利用正交实验技术从不同的溶剂、不同浓度的乙醇、不同提取时间、不同的温度、不同的料液比、不同的提取次数等方面来确定提取罗田甜柿成熟果实中的总三萜的最佳条件。

结果表明，罗田甜柿果肉三萜类物质的最佳提取条件：

乙醇体积分数70％、液料比l：

11、提取时间3h、提取温度85℃、提取两次。

此条件下，罗田甜柿果肉中三萜类物质得率达51.13mg/100gFW。

关键词：

甜柿；三萜类物质；回流提取

OptimizationofPersimmontriterpenoidsisolatedconditions

Abstract:

ToDeterminatethetriperpenescontentandtheoptimalextractionconditionofLuotiantianshipersimmonvariety,thefruit ofSweetPersimmonproducedinluotiancountyHubeiprovincewereusedastherawmaterial.Thetriperpeneswereextractedunderdifferentsolvents,differentconcentrationsofethanol,differentextractiontime,differenttemperature,differentmaterialtosolventratio,anddifferentextractiontimes.Theoptimaltriperpenesextractionconditionwasestablished.Whenthematerialwasextractedwithethanolat85℃for3handattheratioofliquidtomaterial（V/W）1:

11for2times，theextractioncapacityoftriperpeneswas51.13mg/100gFWdeterminedwiththecolorimetryofvanillicaldehyde-aceticacid-perchloricacid.

Keywords:

persimmon;triterpenoids;refluxextraction;

1前言

1.1罗田甜柿简介

罗田素有“甜柿之乡”的美称，罗田境内现有百年以上的甜柿树5000多株，其中錾字石、唐家山的甜柿久有盛名，和日本古老的甜柿“禅寺丸”比较而言，还早180余年。

罗田甜柿主要指的是中国湖北省大别山区罗田县产的甜柿，是中国地理标志产品，也是世界唯一自然脱涩的甜柿品种，生食口感极好。

罗田甜柿是一种水溶性膳食纤维的天然绿色水果，果实橙黄色，果面富有光泽，清香诱人，营养极其丰富。

1.1.1柿子的研究进展

根据中国林科院最新的测定的数据，每100g甜柿鲜果肉的蛋白质含量为0.57-0.67g、可溶性糖为11.68g、含有脂肪0.28-0.30g，并且富含β-胡萝卜素、尼克酸、铁、锌、硒等多种微量元素和维生素B1、B2、E、C[1-3]。

陈湘宁等采用单因素和响应面试验研究超声波提取柿子多糖的优化提取条件，确定了最佳提取工艺条件为液料比18.04mL/g，提取时间32.12民，超声功率405.30W，提取温度40℃[4]。

杨依姗等采用以硫酸为香草醛法优化柿子单宁的提取条件，确定了最佳提取工艺为1.0mL提取液，2.5mL1%香草醛的甲醇溶液以及2.5mL5mol/LH2SO4甲醇溶液混匀后于30℃水浴保温20分钟[5]。

李西柳等通过正交实验对柿叶渣中多酚的提取工艺进行优化，确定了最佳优化条件为料液比为20:

1（mL/g）,提取温度90℃，乙醇浓度40%，提取时间4h[6]。

王恒超等采用微波辅助法提取柿子黄酮，确定了最佳优化条件为乙醇浓度70%，微波功率600W,提取时间150s,料液比1:

30[7]。

顾海峰等探讨了柿子果肉中总酚和缩合单宁的优化提取工艺,采用Folin-Denis法和改良的香草醛-盐酸法分别进行总酚和缩合单宁含量的测定。

通过正交实验确立了含1%盐酸的无水甲醇是最佳提取溶剂,提取最佳条件为提取时间40min、提取温度90℃、料液比1∶12、提取3次[8-9]。

但是，目前对于罗田甜柿的三萜类物质的分离条件的优化研究几乎处于空白阶段。

1.2三萜类化合物介绍

三萜类化合物广泛存在于自然界。

有的以游离形式存在，游离的三萜几乎不溶或难溶于水，可溶于常见有机溶剂。

有的则与糖结合成苷的形式存在，多数可溶于水，水溶液振摇后产生似肥皂水溶液样泡沫，故被称为三萜皂苷（tfiterpenoidsaponins）。

三萜类化合物在菌类、蕨类、单子叶植物、双子叶植物、动物以及海洋生物中均广泛分布，具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞生长、免疫调节等多种生理活性。

1.2.1三萜类化合物的结构特点

萜类化合物是由异戊二烯单位头尾相连生成的天然产物。

大多是由30个碳原子组成的萜类化合物，根据异戊二烯定则，多数三萜是由6个异戊二烯（30个碳）缩合而成的。

1.2.2三萜类化合物的生物合成

研究表明萜类的生物合成途径有两条，在萜类化合物生物合成的两条途径中，最后都是由5个碳原子的焦磷酸异戊烯酯和其双键异构体焦磷酸二甲基烯丙缩合而成各种萜类的前体。

这两条途径分别是甲戊二羟酸途径和脱氧木糖磷酸酯途。

MVA途径位于细胞质和内质网中，而DXP途径则位于质体。

IPP是“活化”的异戊二烯单元，是所有萜类生物合成的中心前体。

萜类生物合成的IPP既可来源于MVA途径，也可来源于DXP途径，或者同时来源于两条途径。

1.2.3三萜类化合物提取方法

三萜类化合物一般采用有机溶剂在常温或低温下提取。

提取物的进一步分离大多采用硅胶、氧化铝、葡萄糖凝胶进行柱层析或采用制备型HPLC进行分离纯化。

目前应用于三萜类化合物的提取方法主要有如下几类。

（1）溶剂提取法

溶剂提取法是根据原料中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对目标成分溶解能力大，对不需要溶出成分溶解能力小的溶剂，将目标成分提取出来的方法。

当溶剂加到原料中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入细胞内，溶解可溶性物质，从而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内溶质不断向外扩散，直至细胞内外浓度达到动态平衡[10]。

目前常用乙醇或甲醇溶液作为溶剂，对原料进行室温浸提、煎煮或加热回流提取，从而获得总三萜提取物。

（2）超声提取法

超声波是频率在20KHz--50MHz的声波，为一种高频率的机械波。

弹性介质的存在是超声波传播的必要条件。

超声波可使细胞因溶剂中瞬间产生的空化气泡的崩溃而破裂，溶剂渗透到细胞内部，使细胞中的溶质溶于溶剂中。

同时，超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解。

超声波提取三萜类化合物具有提取率高，时间短等优点。

（3）微波辅助提取法

微波提取是微波射线透过对微波吸收率较低的溶剂和细胞壁到达细胞内部，由于细胞液吸收微波能，细胞内部温度突然升高，压力增大。

当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，物质释放[11]。

微波辅助提取作为一种新型提取技术已经广泛用于天然产物中黄酮、皂甙、多糖、三萜等有效成分的提取。

但是微波提取法处理量小，限制了其规模化应用。

（4）超临界流体萃取法

超临界流体萃取（Supercriticalfluidextraction，SFE）技术是20世纪60年代兴起的一种新型分离技术。

与传统的提取方法相比，超临界流体萃取法的优点在于可在近常温条件下提取分离不同极性、不同沸点的化合物，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留[12-14]。

因此，其产品纯度高，收率高，操作简单和节省能源。

该技术在近几年发展较快，对萜类物质的提取应用日渐增多，比如马礼金等曾用超临界流体对红芝及其孢子中的三萜类化合物进行提取。

但是超临界提取所需设备价格昂贵，成本较高。

1.2.4三萜类化合物的定量分析方法

对三萜类化合物的定量分析方法有多种，包括重量法、比色法、色谱法等。

由于三萜类化合物的数量众多，结构多样，因此在相关产品质量控制、菌种选育、发酵过程中往往需要测定总三萜的含量。

目前常用于总三萜含量测定的是重量法和比色法。

（1）重量法

重量法测定总三萜的原理是根据三萜类化合物的极性，采用水和氯仿（或乙酸乙酯、正丁醇）对三萜提取物进行分配萃取，将有机相分离后进行浓缩，得到干物质并称重，即为粗三萜。

该方法较为简便，使用较为广泛。

但是该法所得总三萜的纯度不高。

（2）比色法

三萜类化合物通常具有双键、共轭双键结构，因此具有紫外吸收。

有学者根据三萜类化合物在245nm的紫外吸收来测定总三萜酸的含量。

除了紫外比色法，也有学者采用硫酸乙醇显色反应测定总三萜的含量。

紫外比色法和硫酸乙醇显色法都存在样品中干扰物质影响大的缺点。

另据报道三萜类物质在加热条件下可与香草醛和高氯酸发生显色反应，该方法具有灵敏度高、准确度好，重现性佳的优点。

（3）薄层色谱（TLC）技术

薄层色谱（TLC）技术属于吸附色谱，是近年来发展的一种微量、快速和简单的色谱法，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，已被成功用于三萜类化合物的定量分析。

但是TLC对于三萜的测定仍然存在缺陷，如不适合分析总三萜含量、分析准确性差，一般只能做半定量或限度实验。

（4）高效液相色谱（HPLC）技术

高效液相色谱（HPLC）技术具有高效、高分辨率、高灵敏度等特点，常被用于三萜类化合物的定性定量分析。

但是三萜类化合物有数百种，HPLC法一般是以极少数几种三萜为标准品，相应地测定原料或产品中某几种三萜的含量，而对于测定总三萜含量仍然存在困难。

（5）气相色谱技术

气相色谱（GC）技术已被用于测定三萜类化合物，具有灵敏度高、准确度高、重现性好等优点。

但是三萜类化合物大多挥发性较差，因此采用GC法进行定量分析时往往需要将三萜进行衍生化后才能测定，因而一定程度上限制了其应用。

常用的衍生化试剂有双（三甲硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）等。

1.2.5三萜类化合物的生物活性

（1）三萜类物质的抗癌抗肿瘤作用

三萜类化合物是一类具有广泛抗肿瘤等生物活性的化合物，在自然界中分布广泛。

其中，具有显著抗肿瘤活性的主要包括四环三萜和五环三萜，其作用机制主要通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖抑制肿瘤新生血管生成和在线粒体以及基因水平发挥抗肿瘤活性[15-20]。

许多具有抗肿瘤活性的三萜类化合物直接作用于肿瘤细胞，通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖而发挥抗肿瘤活性。

并且，血管生成异常是实体肿瘤发展的重要步骤。

因此，抗血管生成是控制肿瘤生长的重要手段，20（R）--Rg3通过干扰血管生成的多个环节抑制血管生成而具有抗肿瘤活性。

（2）三萜类物质的免疫调节作用

三萜类物质具有增强机体免疫的功能，通过吞噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及细胞因子等进行免疫调节作用[20-23]。

三萜类物质的消炎镇痛作用炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御性反应。

近年来，国内外的许多研究表明许多三萜类物质具有消炎、镇痛作用。

（3）三萜类物质的抗氧化作用

从生物物理学上讲，人衰老特别是皮肤呈现出衰老是由于组成皮肤的细胞内部被氧化而引起的。

这主要是由于人体中存在一种叫自由基的物质，如超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等。

大量实验表明三萜类物质具有清除自由基的能力[23-25]。

三萜类物质是一类重要的天然抗氧化活性物质，具有较高的研究和应用价值。

（4）三萜类物质的抗病毒抑菌作用

植物中广泛存在具有抗病毒、抑菌活性的物质，为人类抵御疾病提供了大量的资源。

三萜类物质抗病毒抑菌作用已经得到医药界的肯定，并且，许多三萜类物质已经广泛地应用到临床上[26]。

从楝科植物中分离得到的三萜类物质——达玛脂酸，在体外试验中表现出强力的抗病毒活性，能够抑制HIV-1的传染。

羊毛甾-8-烯型三萜也表现出抑菌和抗病毒作用。

1.3本课题研究的主要内容

罗田甜柿为大别山地区著名的地标性产品，已受到学术界和消费市场的广泛关注，但是目前其他各国以及我国大陆地区对罗田甜柿的研究很少，因此限制了罗田甜柿的开发利用。

大量研究研究表明，多糖和三萜类化合物为甜柿的主要活性成分之一。

其中，罗田甜柿三萜具有抗氧化、调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、降血压等生物活性。

因此本论文的主要研究内容为：

罗田甜柿果肉三萜类化合物的提取工艺优化。

2材料与方法

2.1实验材料与药品

实验材料：

于罗田县三里畈镇摘取的己成熟的新鲜罗田甜柿果实。

实验药品：

药品：

乙醇、甲醇、正乙烷、乙醚、熊果酸、氯仿、香草醛、冰乙酸、高氯酸（所用试剂均为分析纯，购于上海国药集团）；

2.2主要仪器与设备

电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）、电阻炉（上海一恒科学仪器有限公司）、DSY-1501戴生高速万能粉碎机（永康市九顺莹商贸有限公司）、722S可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、SHZ-D（3）循环水式多用真空泵、RE-5220旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）、电子恒温水浴锅（深圳国华仪器厂）、HH-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；

2.3材料的预处理

将采摘的果实带回实验室后，去除果蒂后洗净，自然晾干后切成块状并去掉种子，称重后，于烘箱中在80℃下烘干至恒重，计算干物质百分含量。

粉碎后用于三萜类物质的提取。

2.4提取条件的研究

2.4.1确定提取的溶剂种类的方法

为了确定提取的溶剂种类，准确称取4份甜柿粉碎物各10.00g，分别加入11倍体积的70%正乙烷、70%乙醚、70%乙醇、70%甲醇，在85℃下水浴回流提取3h，重复提取两次。

2.4.2确定提取时乙醇的浓度的方法

为了确定提取时乙醇的浓度，准确称取5份甜柿粉碎物各10.00g，分别加入11倍体积的60%的乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇，在85℃下水浴回流提取3h，提取两次。

2.4.3确定提取时间的方法

为了确定提取时间，准确称取5份甜柿粉碎物各10.00g，加入11倍体积的70%乙醇，分别在85℃水浴回流提取2h、3h、4h、5h、6h，提取两次。

2.4.4确定提取温度的方法

为了确定提取温度，准确称取4份甜柿粉碎物各10.00g，加入11倍量的70%乙醇，分别在65℃、75℃、85℃、95℃水浴回流提取3h，提取两次。

2.4.5确定料液比的方法

为了确定料液比，准确称取5份甜柿粉碎物各10.00g，分别加入9倍体积、11倍体积、13倍体积、15倍体积、17倍体积的70%乙醇，置于85℃下水浴回流提取3h，提取两次。

2.4.6确定最佳提取次数的方法

为了确定最佳提取次数，准确称取5份甜柿粉碎物，每份10.00g，加入11倍体积的70%乙醇，置于85℃水浴下回流提取3h，分别提取1次，2次，3次，4次，5次，6次。

2.5香草醛-冰乙酸、高氯酸显色法测定提取液中总三萜的含量

所有提取液分别过滤后经旋转蒸发减压浓缩，浓缩液定容后，以熊果酸为标准品，采用香草醛-冰乙酸、高氯酸显色法[34]，在560nm波长下测定吸光值，测三次，确定三萜类物质的含量。

3结果与分析

3.1提取溶剂种类的确定

总三萜浓度（mg/100gFM）

溶剂种类为70%正乙烷、70%乙醚、70%乙醇、70%甲醇的总三萜提取量分别为：

13.25mg/100gFW（鲜果）、30.43mg/100gFW、45.36mg/100gFW、43.13mg/100gFW。

由图1可知，甲醇、乙醇等极性较强的溶剂的提取效果明显优于极性弱的溶剂乙醚或正己烷。

因此以70%乙醇的提取效果最优。

溶剂种类

图1不同溶剂对总三萜提取的影响

Fig.1Theeffectofdifferentsolventsontheextractionoftriperpenes

3.2提取溶剂浓度的确定

不同溶剂总三萜提取量结果见图2。

乙醇浓度为60%、70%、80%、90%、100%的总三萜类化合物提取量为38.96mg/100gFW、50.09mg/100gFW、45.36mg/100gFW、42.73mg/100gFW、19.87mg/100gFW。

由图可知乙醇溶度从60%升至70%的过程中，三萜类化合物的含量是随着提取液的溶度升高而升高；随后继续升高乙醇浓度至80%、90%/、100%，三萜类物质的提取量随之下降。

其中70%乙醇所提取的三萜类物质含量最高。

乙醇浓度

图2乙醇浓度对总三萜提取的影响

Fig.2Theeffectofethanolconcentrationontheextractionoftriperpenes

总三萜浓度（mg/100gFM）

3.3提取时间的确定

不同提取时间条件下总三萜提取量结果见图3。

回流提取时间为2h、3h、4h、5h。

所提取的三萜类物质的含量分别为41.32mg/100gFW、49.76mg/100gFW、49.97mg/100gFW、50.13mg/100gFW；由图3可知，在提取时间为2h时，总三萜提取的量最低，为41.32mg/100gFW，随着浸提时间的增长，总三萜的提取量有所提升，但是升高的幅度十分的小，并不明显。

当回流提取的时间延长为6h时，三萜类物质的提取量为49.36mg/100gFW，相较于之前有所下降，所以提取时间并不是越长越好。

因此出于时间和效益的综合考虑，提取时间为3h较为合适。

总三萜浓度（mg/100gFM）

提取时间

图3提取时间对总三萜提取的影响

Fig.3Theeffectofextractiontimeontheextractionoftriperpenes

3.4提取温度的确定

不同温度条件下总三萜提取量的结果见图4。

由图4可知，提取温度为65℃、75℃、85℃、95℃三萜类物质的提取量分别为：

20.21mg/100gFW、37.12mg/100gFW、50.03mg/100gFW。

随着温度从65℃依次升高至85℃而增加，当温度再升高到95℃时，其提取量随之下降到48.87mg/100gFW。

因此，提取罗田甜柿中三萜类物质的最适温度为85℃。

提取温度

图4提取温度对总三萜浓度的影响

Fig.Theeffectofextractiontemperatureontheextractionoftriperpenes

总三萜浓度（mg/100gFM）

3.5提取料液比的确定

图5是不同料液比的提取结果。

由图5可知，在料液比较低的情况下，罗田甜柿中三萜类物质的提取量也较低，为18.13mg/100mFW。

而当料液比上升至1：

11时，罗田甜柿中三萜类物质的提取量升高到49.97mg/100mlFW；但是当料液比依次升高为1:

13、1:

15、1:

17时，三萜类物质的提取量明显下降。

由此，可以得出罗田甜柿提取效果最佳的料液比为1:

11。

料液比

图5料液比对总三萜的影响

Fig.5Theeffectofmaterialandsolventratioontheextractionoftriperpenes

总三萜浓度（mg/100gFM）

总三萜浓度（mg/100gFM）

3.6提取次数的确定

图6为不同提取次数时的提取结果。

提取一次到提取五次所提取的总三萜类化合物浓度从分别为：

26.53mg/100gFW、51.13mg/100gFW、31.79mg/100gFW、35.95mg/100gFW、33.18mg/100gFW。

由图6可知，当提取次数为1次的时候，罗田甜柿果实总三萜的提取量最低为26.53mg/100gFW，提取次数为两次时，其三萜类化合物的提取量达到最大为51.13mg/100gFW；且随着提取次数的再次增加，三萜类物质的提取量随之的减少。

因此可知罗田甜柿果实的最佳提取次数为两次。

图6提取次数对总三萜的影响

Fig.6Theeffectofextractiontimeontheextractionoftriperpenes

总三萜浓度（mg/100gFM）

提取次数

4结论

在所选择的几种提取溶剂中，以乙醇的提取效果最好，其次是甲醇，乙醚提取效果不佳，最差的是正乙烷。

分析原因可能是回流提取溶剂的极性大小有关。

根据相似相溶原理，极性越接近三萜类物质极性的提取效果越好。

当乙醇浓度超过70％时，由于一些醇溶性物质的溶出增加，因而对总三萜的提取量造成影响。

所以，乙醇浓度70％时为提取效果最佳。

在提取时间方面，从逻辑上来看，提取时间越长，提取量越高，效率越高。

但是提取的时间太长，有的三萜类物质会因此而降解，从而影响总三萜的提取量。

出于效率和效益的综合考虑，在提取罗田甜柿果实中三萜类化合物时，最佳的时间是3h。

随着水浴温度的升高，分子的热运动加快，罗田甜柿果实中三萜类物质的提取量随之增加，而温度达到85℃时提取量最大，随着温度的继续升高，提取率将逐渐降低。

这是由于三