环氧乙烷灭菌器灭菌验证报告.docx
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环氧乙烷灭菌器灭菌验证报告
***
环氧乙烷灭菌验证报告
文件编号
***
文件版本
A/0
生效日期
2012年12月12日
文件分发明细
副本：
□总经理□管理代表□副总经理
□生产技术部□生产部□质量部
□供销部□总经办
正文：
文控中心盖受控章
制订
审核
批准
制订日期
2012年12月30日
审核日期
2012年12月30日
批准日期
2012年12月30日
修改记录
版号
修改状态
修改内容
制订/日期
审核/日期
批准生效/日期
1验证目的
1．1我公司根据ISO11135进行灭菌验证，我公司成立验证小组，主要成员见验证小组成员表。
1。
2通过验证确认来证明确定过程是有效的，可再现的，保证最终产品的无菌概率小于或等于SAL10-6。
1适用范围
本方案适用***公司生产的***，及以其有相同组成材料和制造过程的相关产品的EO灭菌。
2参照标准
1.1ISO11135-1:
2007,Sterilizationofhealthcareproducts—Ethyleneoxide—Part1:
Requirementsfordevelopment,validation,androutinecontrolofasterilizationprocessformedicaldevices.
2.1ISO10993-7，Biologicalevaluationofmedicaldevices-Part7:
Ethyleneoxidesterilizationresiduals
2.2ISO11737-1:
2006,Sterilizationofmedicaldevices-Microbiologicalmethods-Part1:
Determinationofapopulationofmicroorganismsonproducts.
2.3ISO11138-1:
2006，Sterilizationofhealthcareproducts--Biologicalindicators-Part1:
Generalrequirements.
2.4ISO11138-2:
2006，Sterilizationofhealthcareproducts--Biologicalindicators-Part2:
Biologicalindicatorsforethyleneoxidesterilizationprocesses.
2.52005版《中国药典》附录XVIXIH，灭菌法无菌检查法。
3验证小组成员及职责
表1.小组成员
姓名
所在部门
职务
本验证工作中职责
行政部
经理
验证方案的编写、指导以及协助验证
设计部
经理
验证方案的协助设计
生产部
厂长
监督系统正常供水
生产部
主任
系统安装维护及跟踪系统正常运行
质量部
检验员
无菌检验、残留量检测
管理层
总经理
验证方案的审批
管理层
管代
验证实施和检验
所有操作人员均接受相关知识的培训，详见操作人员培训记录。
1.设备和材料
解析室
有效容积：
4480mm×1350mm×1700mm
温度：
室温
湿度：
60%-90%
解析室与清新空气循环速度：
5300m3/h
在空气的入口处和出口处各有一个风扇（送风量5300m3/h,风扇转速1450r/min）。
灭菌器
EO灭菌器名称：
供应商:
材料:
不锈钢
容积:
安装时期:
2012年11月
温度传感器
制造商:
型号:
灵敏度:
湿度传感器
制造商:
型号:
灵敏度:
环氧乙烷（EO）混合
成份：
供应商：
批号:
2012/11/16
气体的检测报告详细见供应商出货单
生物指示剂（BI）
微生物名称：
供应商：
规格：
D值：
批号：
过期日期:
产品证明见附件3：
BI资质报告
培养基
（营养琼脂）；（玫瑰红琼脂）；（硫乙醇流体培养基）；（营养肉汤）；（改良马丁培养基）。
EO残留测试
测试中心：
测试设备：
参考标准：
ISO10993-7（GB/T14233）
2.操作流程及参数
图1.灭菌流程及灭菌参数要求
2.1.加热：
将灭菌系统总电源接通，设定温度的上下限值，将加热开关推向“开”的位置，系统启动加热/循环，对灭菌柜进行加热，当温度达到设定值后，系统自动停止加热，保持温度衡定。
2.2.保温：
产品被推入后，关好灭菌柜门，设定保温时间，对灭菌产品进行加热。
2.3.抽真空：
当保温时间结束后，启动真空泵，设定压力值，将真空阀推向“开”的位置，系统对灭菌柜进行抽真空，当达到设定值后，系统自动停止。
2.4.加湿：
抽真空后结束后，如果湿度≤30%，需对产品进行加湿，当湿度达到40%～60%时停止加湿。
2.5.保压：
在预定的负压值下保持30min，使产品包装内的空气排出，同时记录产品中所有温度、湿度传感器的值。
2.6.加药：
向灭菌柜内注入预定量的灭菌剂，如2kg，同时记录气化器的温度、灭菌剂的温度，加药前压力、加药后压力、加药时间，并用这些数据用气体状态方程式计算灭菌柜内灭菌剂的浓度，同直接称量法比较所得的值应一致（证明灭菌剂全部被加入）。
计算公式如下：
浓度=（K*P）/（R*T）
K：
稀释常数：
44000
P：
引入E.O后压力上升值
R：
气体常数（纯气：
T：
引入后，箱体内绝对温度（273＋t）
2.7.灭菌：
按预定时间设定好灭菌时间，记录灭菌开始时灭菌柜内压力、灭菌结束时灭菌柜内压力、灭菌开始15min时产品中湿度传感器的湿度值、整个灭菌过和产品中温度传感器的值。
2.8.气洗：
灭菌结束时，排出灭菌剂，设定抽真空到-20±2Kpa,保持3min，打开排空阀，空气进入，按这样的循环两次，同时记录灭菌柜内压力的变化值。
2.9.产品推出：
气洗结束后，将放空阀推向“开”的位置，空气进入灭菌柜，打开灭菌柜门，将灭菌“合格”的产品送入解析室。
2.10.解析：
记录解析室内温度范围，新鲜空气换流流量，并根据以往经验在不同时间点对产品进行E0残留量测试，找出产品EO、ECH残留合格的最短解析时间。
3.灭菌产品的装载及监测传感器的分布
产品的装载
根据产品的包装设计特点及灭菌箱容积要求确定灭菌产品装载量为：
90个销售包装/灭菌箱；共90灭菌箱/灭菌批，总使用空间为：
4480mm×1350mm×1700mm
（a）正面模式图（b）顶视模式图
有效装载（正面图）
图2.在灭菌器中灭菌箱的装载和产品在灭菌箱中的放置
每个手术衣外面套一个透析袋，然后25个独立袋装一个纸箱，包装封口参数及包装材料见手术衣包装确认报告（TB/TS/02V-02-01）.
温度和湿度传感器分布
依据标准ISO11135进行运行确认和性能确认的时候，需要用10个湿度传感器和2个湿度传感器来监测灭菌柜中的温度和湿度情况，传感器放置图见图3。
传感器（1,2,3,4,6,7,8,9,）被贴于灭菌器室壁相应位置（磁性吸附），传感器5,10,11和12被细线挂于灭菌柜内图3中相应的位置。
在做性能确认，装载样品的情况下，所有传感器均用同产品一样的包装材料装好，参照运行确认放置的位置，放于灭菌产品之间，这些点包括已确认过的最冷点。
图3.温度及湿度传感器放置图
表2.温度和湿度传感器对应表
位置编号
温度传感器
湿度传感器
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
传感器编号
T029
T026
T028
T032
T027
T031
T035
T033
T030
T034
M62254
M33708
4.安装确认
设备购买于2012年11月，2012年11月安装调试完毕，安装确认依照标准ISO11135-1的要求按灭菌确认方案，进行确认,确认内容包括：
1）确认设备相关技术资料；
2）计量器具校准；
3）设备安装环境确认；
4）管道的安装确认；
5）电器控制系统安装确认。
安装确认结果确认报告
5.运行确认
1）灭菌器灭菌室箱壁及空间温度均匀性试验：
根据ISO11135-1标准要求，选用10个贴触式温度传感器直接贴触柜壁和悬挂于柜室空间（具体分布如图3），启动加热/循环系统，在到达灭菌工艺所需温度（50℃）时，所有传感器记录的温度均在50℃±3℃的范围内，其中5位置处的温度传感品器所记录的温度为最低点，此位置位于灭菌器的柜门。
2）真空速率试验：
在空载的情况下，将灭菌柜温度升到50℃±3℃，保持温度衡定，将灭菌柜门关好，封闭柜门，启动真空泵，将真空阀开关推向“开”的状态，真空度达到-50kPa时,记录时间（t2），同时关闭真空阀，保持60min，结果真空至-50Kpa所用时间（t2）<30min。
3）正压泄漏试验：
在空载的情况下、将灭菌柜温度升到50℃±3℃，保持温度衡定，将灭菌柜门关好，封闭柜门，打开气泵，向柜内加压至50Kpa，保持60min，结果一小时泄漏小于Kpa。
4）负压泄漏试验：
在空载、温度恒定的条件下（50℃±3℃），封闭柜门，启动真空泵，将真空阀开关推向“开”的状态，抽真空至-50Kpa，保压60min，结果一小时泄漏小于Kpa。
5）在空载条件下，保持灭菌室温度恒定（50℃±3℃），将蒸汽发生器的电源开关打开，当蒸汽发生器压力达到50Kpa时，打开加湿开关，向柜内加蒸汽，40min内，温度升到75%，蒸汽发生器有效。
总之,运行确认结果表明设备能达到灭菌过程所要求的性能参数范围。
详细见性能确认。
6.物理性能确认
确认3个半周期和2个全周期的物理性能，所有物理性能确认参数数据见EO灭菌记录,3个半周期和2个全周期的物理性能参数数据总结分别见表3和表4。
在3个半周期物理性能确认时，灭菌参数采用极端条件（温度37℃和灭菌介质EO=Kg），2个全周期也利用极端条件（温度43℃和灭菌介质EO=Kg）。
在所有灭菌周期内，灭菌装载样品量和传感器的放置同本文7部分中描述一样，温度传感器放置位置包括运行确认中认为最冷的点，所有灭菌周期内的温度和湿度记录见灭菌产品温度均匀性记录和灭菌产品湿度均匀性记录，结果显示设备性能稳定，满足灭菌需求。
表3.半周期物理性能确认结果
过程
确认项目
半周期参数记录
半周期1灭菌时间
半周期2灭菌时间
半周期3灭菌时间
2012-12-5
2012-12-6
2012-12-7
加热
起始温度（℃）
25
20
23
最终温度（℃）
37
37
37
所用时间（min）
30
35
40
产品推入
保温
所用时间（min）
29
29
30
10个温度传感器中最大值（℃）
10个温度传感器中最低值（℃）
35
10个温度传感器平均值（℃）
抽真空
起始压力（kPa）
0
最终压力（kPa）
所用时间（min）
3
4
3
湿度最大值
湿度是小值
湿度平均值
61
58
加湿
注入蒸汽前灭菌室内压力（kPa）
-
-
-
注入蒸汽时间（min）
-
-
-
注入蒸汽后灭菌室内压力（kPa）
-
-
-
保压
时间（min）
29
30
30
10个温度传感器中最大值（℃）
10个温度传感器中最小值（℃）
10个温度传感器平均值（℃）
2个湿度传感器最大值（%RH）
2个湿度传感器最小值（%RH）
2个湿度传感器平均值（%RH）
加药
EO注入前灭菌室内压力（kPa）
EO注入重量（kg）
EO注入后灭菌室内压力（kPa）
EO注入所用时间（min）
4
6
4
EO注入时汽化器温度最小值（℃）
EO注入时EO的温度最小值（℃）
灭菌
气体作用时间（min）
240
240
240
作用开始时灭菌室内压力（kPa）
61
作用结束时灭菌室内压力（kPa）
作用15min后灭菌器的湿度（%RH）
作用过和中产品最大温度值（℃）
37
37
作用过程中产品最大温差值（℃）
作用过程中产品之间的温差（℃）
作用15min时EO浓度（mg/L）
570
570
570
气洗
换气前的压力（kPa）
换气后的压力（kPa）
-20
换气间隔时间（min）
1
1
1
换气次数（times）
2
2
2
表4.全周期物理性确认结果
过程
确认项目
全周期灭菌参数记录
全周期1灭菌时间
全周期2灭菌时间
2012-12-7
2012-12-7
加热
起始温度（℃）
21
24
最终温度（℃）
43
43
所用时间（min）
53
46
产品推入
保温
所用时间（min）
29
30
10个温度传感器中最大值（℃）
10个温度传感器中最低值（℃）
10个温度传感器平均值（℃）
抽真空
起始压力（kPa）
最终压力（kPa）
-48
所用时间（min）
4
6
湿度最大值
39
湿度是小值
湿度平均值
38
加湿
注入蒸汽前灭菌室内压力（kPa）
-
-
注入蒸汽时间（min）
-
-
注入蒸汽后灭菌室内压力（kPa）
-
-
保压
时间（min）
30
29
10个温度传感器中最大值（℃）
10个温度传感器中最小值（℃）
10个温度传感器平均值（℃）
2个湿度传感器最大值（%RH）
2个湿度传感器最小值（%RH）
2个湿度传感器平均值（%RH）
加药
EO注入前灭菌室内压力（kPa）
EO注入重量（kg）
EO注入后灭菌室内压力（kPa）
65
EO注入所用时间（min）
6
6
EO注入时汽化器温度最小值（℃）
EO注入时EO的温度最小值（℃）
灭菌
气体作用时间（min）
480
480
作用开始时灭菌室内压力（kPa）
作用结束时灭菌室内压力（kPa）
68
作用15min后灭菌器的湿度（%RH）
作用过和中产品最大温度值（℃）
42
作用过程中产品最大温差值（℃）
作用过程中产品之间的温差（℃）
作用15min时EO浓度（mg/L）
630
630
气洗
换气前的压力（kPa）
68
换气后的压力（kPa）
换气间隔时间（min）
1
2
换气次数（times）
2
2
产品送入解析室
解析
解析时间（h）
7
7
解析室温度范围（℃）
20-39
20-39
换气流量（min/once）
连续
连续
7.生物性能确认
生物性能确认包括以下内容：
培养基灵敏度：
对所用培养基进行无菌检查和灵敏度检查；
灭菌产品的生物负载：
检测确认灭菌前产品的生物负载小于100CFU/件；
初始微生物挑战：
在空载情况下灭菌10min的，测试BI的抵抗性；
短周期：
寻找一个没有微生物存活下来的最短灭菌时间，能达到SAL10-6；
半周期：
确认半周期的重复性；
全周期：
确认两个全周期后产品的性能和包装的性能。
根据半周期法及ISO11135-1中生物性能确认要求，如“图4.半周期法”。
该方法能保证灭菌过程杀灭具有特定抵抗性的微生物芽孢，其方法在所有其它参数保持不变（所有关键参数都应设置为下限，以保证这种最差条件均能满足要求），找到没有微生物存活的灭菌效果时需要的最短灭菌时间。
在检测生物指示剂（BI）显示没有微生物生长的情况下，还要再重复两次灭菌过程，而且检测均无微生物生长，确立的这一个灭菌时间，再用2倍于这一个灭菌时再进2次灭菌循环运行（所有关键参数都设置为上限、以保证最恶劣条件均不损害产品及包装的性能），灭菌循环如图7所示，并加载性能测试和EO、ECH测定的产品样品。
图4半周期法
11.1培养基灵敏度测试
过程依照培养基灵敏度检查方法（中国药典2012），对本批次的培养基进行确认，灵敏度检查前已经对培养基进行无菌性检查，培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数小于5代，生命活力旺盛。
所测试的培养基包括：
营养琼脂培养基（NA）、孟加拉玫瑰红琼脂培养基（RBA）、硫乙醇酸盐流体培养基和营养肉汤培养基（NB）。
a）NA：
将金黄色葡萄球菌接种于被检的营养琼脂培养基（NA），经30℃～35℃培养18h～24h后，刮取菌落于%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液，在再逐管稀释成浓度＜100CFU/ml的菌悬液，取1ml菌悬液于无菌的的平皿中，接种3个平皿，分别浇注温度不高于50℃的灭菌后（NA），凝固后翻转平皿置于所需温度培养，并用未加菌液的（NA）平皿作空白对照，30℃～35℃培养24h～48h,观察结果。
b）RBA：
将白色念珠菌接种于被检的孟加拉玫瑰红琼脂培养基（RBA），经23℃～28℃培养24h～28h后，刮取菌落于%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液，再逐管稀释成浓度＜100CFU/ml的菌悬液，取1ml菌悬液于无菌的的平皿中，接种3个平皿，分别浇注温度不高于40C的灭菌后的（RBA），并用未加菌液的（RBA）平皿作空白对照，23℃～28℃培养24h～48h,观察结果。
c）凝固后翻转平皿置于所需温度培养。
d）NB：
将已知含菌量为2×106CFU/片的枯草芽孢杆菌菌片，用无菌的玻璃珠加10ml的％无菌氯化钠溶液将其混匀成菌悬液后，再逐管稀释成浓度＜100CFU/ml的菌悬液，取1ml菌悬液接种于20ml的营养肉汤（NB）培养管，接种3管，并用未接种的20ml的NB做空白对照管，30℃～35℃培养3～7d，观察结果。
e）硫乙醇酸盐流体培养基：
将生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培养基，经30℃～35℃培养18～24h后，无菌操作取出菌液用％无菌氯化钠溶液将其混匀成菌悬液后，再逐管稀释成浓度＜100CFU/ml的菌悬液，取10只无菌试管，每只试管加入12ml硫乙醇酸盐流体培养基，将其中9只试管分成3组，每组3只，分别在每组中各加入1ml细菌数＜100CFU/ml的生孢梭菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌悬液，所有试管均置于30℃～35℃培养培养3～7d，并用未接种细菌的试管做空白对照，观察结果。
结果：
经过培养后，所有接种细菌数＜100CFU/ml菌液的培养基均长菌，灵敏度达到要求，所有记录见培养基灵敏度测试报告。
11.2灭菌前产品生物负载测试
灭菌前产品的生物负载测试过程依照-初始污染菌检测方法、初始污染菌的确定和ISO11737-1灭菌医疗器械-生物测试方法-第1部分:
产品上微生物数量的确认。
从每一批产品中抽取一件产品，按照下列已经确认方法，对灭菌前的手术衣进行生物负载评估。
以确定手术衣产品的生物负载水平。
步骤:
-从已包装好的产品中，每一批抽取一件产品，投入100ml，%蛋白胨水溶液中，蜗旋振荡30s。
-制成1：
10，1：
100等稀释级供试液中。
-取供试液2ml于两个无菌的平皿中，每个1ml，分别注入温度不高于40C的营养琼脂培养基（NA）和孟加拉玫瑰红琼脂培养基（RBA），凝固后翻转平皿置于所需温度培养。
-根据菌落数估算出该类产品的生物负载水平，详细见产品的生物负载测试报告
注：
对手术衣生物负载做厌氧菌检测，结果未能检出厌氧菌，确定手术衣负载中不存在厌氧菌，同时从产品结构分析也证明手术衣不存在厌氧菌生存的环境。
11.3初始微生物性能挑战
BI在空的灭菌柜中经过一个灭菌周期循环后，灭菌剂作用10min，取出BI投入营养肉汤培养基中经30-35℃培养3-7天，结果显示灭菌10min后，所有BI均有菌生长
11.4短周期
按本文7的描述装载灭菌产品，依照本文6部分的过程进行短周期循环，EO的作用时间分别为30min,60min,120min,240min。
所有重要参数均设定为下限（温度=37℃，灭菌介质EO=Kg），灭菌循环结束后，分别将样品和BI进行无菌测试。
短周期灭菌器运行条件：
温度：
47℃（设定值的下限）
灭菌介质EO注入量：
10Kg（设定值的下限）
EO作用时间：
30min,60min,120min,240min。
BI分布：
在短周期，半周期和全周期灭菌循环中，所有BI均密封于透析袋中，置于手术衣中间，以最终灭菌包装包装好“产品”，其中最大的手术衣，内部面积最大，热量最难传导进入手术衣中心，所用材料最多，体积最大，气体最难进入内部，这样的产品代表了所有手术衣中最难灭菌的情况，将BI放于这样的产品中心，作为过程挑战装置（PCD）。
将PCD均匀的放置于灭菌柜中，这些位置包括灭菌柜中最难灭菌的位置,如靠门的地方，此处在整个灭菌柜中温度是最低的位置，灭菌柜的上层，此处是灭菌剂浓度最低的位置，保证这些最差情况下达到SAL10-6无菌水平。
20个BI在灭菌器中的位置见图4.,这些位置包括温度最低，EO最难到达的位置。
图4.灭菌柜内BI分布示意图
产品的装载：
取三批合格产品，每批520个，包装好后用于灭菌装载产品，这三批装载产品经过一次灭菌后，送入解析室去除EO，重复用来做下一次灭菌过程的装载产品，装载方式见本文7部分。
生物负载测试样品、性能确认测试样品、内毒素测试样品和EO、ECH残留测试样品均为合格产品，见表5.6个样品用来做生物负载测试，20个样品经短周期1灭菌后做产品无菌测试，20个样品经第一次全周期灭菌后从中抽出3个样品（黄色）作性能测试，3个样品（绿色）用来做内毒素测试，左边14个样品（蓝色）和其它6个新加入的样品经全周期2灭菌后，其中9个样品（蓝色）已经经受2次全周期灭菌循环，用来确认经两次灭菌后产品的性能是否受到破坏，证明二次灭菌的可行性，左边11个样品经二次全周期灭菌后用，作EO残留测试样品。
表5.测试样品
生物负载测试样品（6件）
短周期1后样品的无菌测试（20件）
全周期1样品（20件）
性能测试样品（3件）
内毒素测试样品（3件）
全周期2样品（20件）
二次灭菌性能测试样品（9件）
EO/ECH残留测试样品（11件）
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