血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定作业指导书.docx
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血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定作业指导书
血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定作业指导书
1.实验原理
碱性磷酸酶的活性由在pH值为10.4，2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下测量p-硝基-磷酸苯酯（pNPP）的转换速率决定。
ALP
pNPP+AMP-----------﹥pNP+AMP-PO4
在410/480nm测定pNP的生成速率，它与标本中ALP的活性成正比。
2.标本采集与处理：
2.1病人准备：
无特殊要求。
2.2标本类型：
标本最好是无溶血的血清或肝素化的血浆。
2.3血清分离：
应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3.标本存放：
2～3天内的活性损失：
15～25℃保存：
<10%；标本稳定性：
4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
4.标本运输：
常温条件下运输
5.标本拒收标准：
细菌污染的不能做测定。
6.实验材料：
6.1上海申能ALP测定试剂盒（14104171701试剂16×64ml＋试剂26×16ml）
6.1.1试剂组成
试剂1：
2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）缓冲液0.90mol/L（pH:
10.4）
醋酸镁1.6mmol/L
硫酸锌0.4mmol/L
HEDTA2.0mmol/L
试剂2：
磷酸对硝基酚16.0mmol/L
6.1.2试剂准备：
试剂为即用式。
6.1.3试剂稳定性与贮存：
原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.4变质指示：
当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5注意事项：
碱性磷酸酶试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。
反应过程中产生的对硝基苯酚有毒性，切勿吸入、吞食、接触皮肤或粘膜。
若反应液与皮肤或粘膜接触，请速用水冲洗。
6.2校准品：
使用DiaSys公司提供的TruCalU校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
6.3质控品：
参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
7.仪器：
奥林巴斯AU1000生化分析仪
8.操作步骤
8.1项目基本参数：
参见生化检验奥林巴斯AU1000生化分析仪项目测定参数.SOP文件
8.2仪器操作步骤：
参见生化检验奥林巴斯AU1000生化分析仪操作规程.SOP文件
9.检验结果的判断与分析
10.质量控制：
在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。
11.计算方法：
以TruCalU复合校准品ALP校准值校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果。
不使用校准品进行ALP活力检测，可以直接使用ΔA/min均值乘以计算因子得到结果，但是这样所得结果的可靠性不如使用校准品。
计算ALP活力的计算因子见下：
ΔA/min×因子=ALP活力[U/L]
底物起始的反应（37℃）样品起始的反应（37℃）
05nm34332757
12.参考值范围
成年人[4]
男性20～50岁53～128U/L
男性60岁以上56～119U/L
女性20～50岁42～98U/L
女性60岁以上53～141U/L
儿童[5]
男性女性
1～30天75～319U/L48～406U/L
1个月～1岁82～383U/L124～341U/L
1岁～3岁104～345U/L108～317U/L
4岁～6岁93～309U/L96～297U/L
7岁～9岁86～315U/L69～325U/L
10岁～12岁42～362U/L51～332U/L
13岁～15岁74～390U/L50～162U/L
16岁～18岁52～171U/L47～119U/L
参考值因性别、年龄、饮食和地域的不同而有所差别。
根据好的实验室经验，每个实验室应建立自己的参考值。
13.临床意义[1,2]：
碱性磷酸酶（ALP）是一种在碱性条件下具有较强活性的水解酶，并以多种形态存在于血液中，其大多来自骨骼的成骨细胞和肝脏，也来源于其他一些组织例如肾脏、胎盘、肠、睾丸、胸腺、肺及肿瘤。
在儿童生长期和妊娠期，血清中ALP生理性活性增高，骨疾病与肝胆疾病等引起ALP病理性活性增高。
在肝胆疾病中引起ALP活性增高的原因包括胆道梗阻，例如因胆结石、肿瘤或炎症造成的胆汁郁积。
在传染性肝炎中也可发现ALP活性增高。
在骨疾病中，Paget病、骨软化症（佝偻病）、骨转移瘤和甲状旁腺功能亢进等，使成骨活性升高引起ALP活力增高。
14.操作性能
14.1线性范围2～850U/L
14.2精密度：
精密度的评估是根据NCCLS推荐的典型方法5，AU1000批内不精密度小于5%，总不精密度小于10%。
用于分析的质控血清和数据处理符合以上的NCCLS的规则7。
批内精密度
n=20
（U/L）
s
（U/L）
CV
（%）
批间精密度
n=20
（U/L）
s
（U/L）
CV
（%）
样品1
97.8
1.15
1.18
样品1
103
1.06
1.02
样品2
189
1.82
0.96
样品2
188
1.04
0.55
样品3
235
1.68
0.72
样品3
236
1.64
0.70
14.3方法学比较：
本公司试剂盒（y）与某商品化试剂盒（x），同时对78个样品进行ALP活力检测，将检测结果作方法学比较，其统计结果如下：
y=1.00x+0.00U/L；r=0.999。
14.4灵敏度：
本试剂的检测限为2U/L。
14.5病人结果可报告范围：
2～850U/L
15.超出范围结果处理：
本法对ALP活力检测的最大ΔA/min在405nm为0.25。
当样品测定值超过上限时，应将样品用9g/L氯化钠溶液作1+9稀释，重新测定，结果乘以10。
16.病危报警值的处理
17.方法局限性
17.1本法对ALP活力检测的最大ΔA/min在405nm为0.25。
当样品测定值超过上限时，应将样品用9g/L氯化钠溶液作1+9稀释，重新测定，结果乘以10。
17.2干扰物质：
当样品中抗坏血酸浓度1704mol/L，胆红素浓度684mol/L，血红蛋白浓度2.00g/L，甘油三酯浓度22.6mmol/L时没有观察到干扰
18.补救措施：
当仪器发生故障时，迅速联系仪器厂家进行维修。
19.参考文献
1.ThomasL.ClinicalLaboratoryDiagnostics.1sted.Frankfurt：
TH-BooksVerlagsgesellschaft;1998.p.36-46.
2.MossDW,HendersonAR.Clinicalenzymology.In：
BurtisCA,AshwoodER.editors.Tietztextbookofclinicalchemistry.3rded.Philadelphia：
W.B.SaundersCompany;1999.p.617-721.
3.TietzNW,RinkerD,ShawLM.IFCCmethodforalkalinephosphatase.JClinChemClinBiochem1983;21：
731-48.
4.BurtisCA,AshwoodER.editors.Tietztextbookofclinicalchemistry.3rded.Philadelphia：
W.B.SaundersCompany;1999.p.1829.
5.SoldinJS,HicksJM.Pediatricreferenceranges.Washington：
AACCPress,1996.p.5.
20.其他：
仪器测定后的废液及难降解的材料集中收集后按《检验科废物处置管理规定》执行。
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