流式细胞仪标本的制备.docx

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流式细胞仪标本的制备

流式细胞仪标本的制备

    流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。

（一）　原理

　　活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

（二）　操作步骤

　　制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液）FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7天）

　　（三）　试剂和器材

　　1.　各种特异性单克隆抗体。

　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

　　3.　10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。

　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

　　（四）　注意事项

　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:

　　1.DPBS（×10,贮存液）　NaCl80g　KCl2g　蒸馏水加至1000ml　　Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释　KH２PO４2g

　　2.　洗涤液　DPBS　900ml　FCS50ml（终浓度　5％）　4％NaN３50ml（终浓度0.2％）

　　3.　固定液　DPBS　1000ml　葡萄糖　20g（终浓度2％）　甲　醛　10ml　NaN３　0.2g（终浓度0.02％）

流式细胞仪标本的制备

流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的

结果。

（一）　原理

　　活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

（二）　操作步骤

　　　　　制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、

　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为

　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）

　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20（用DPBS

　　　　　　　　稀释）灭活正常兔血清

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃30min

　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右

　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠

　　　　　　　　　（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃30min

　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右

　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入

　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，

　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液）

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察

　　　　　　　　　　（标本在试管中可保存5～7天）

　　（三）　试剂和器材

　　1.　各种特异性单克隆抗体。

　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

　　3.　10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。

　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

　　（四）　注意事项

　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

　　附:

　　1.DPBS（×10,贮存液）

　　　　NaCl80g

　　　　KCl2g　　　　　蒸馏水加至1000ml

　　　　Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释

　　　　KH２PO４2g

　　2.　洗涤液

　　　　DPBS　　　　　　900ml

　　　　FCS50ml（终浓度　5％）

　　　　4％NaN３50ml（终浓度0.2％）

　　3.　固定液

　　　　DPBS　　　　1000ml

　　　　葡萄糖　　　　20g（终浓度2％）

　　　　甲　醛　　　　10ml

　　　　NaN３　　　0.2g（终浓度0.02％）

流式细胞仪实验方法

一、 实验准备

1． 标本制备：

2． 最小化非特异性结合：

二、凋亡

1．凋亡的检测方法：

网站和其它

2．PI染色法

3．AnnexinV法

4．TUNNEL法

三、细胞因子

1．激活的细胞因子

2．CBA

四、血小板

1．活化

2．活化检测

3．网织血小板

五、红细胞

1．网织红细胞

2．PNH

3．胎儿红细胞

六、肿瘤学

1．DNA细胞周期

2．蛋白

3．多药耐药

4．微小残留白血病

第一部分 标本处理

一、流式细胞术常规检测时的样品制备

（一）直接免疫荧光标记法

 取一定量细胞（约1X106细胞／ml），在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上（）,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），。

孵育20-60分钟后，用PBS（pH7．2—7．4）洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

（二）间接免疫荧光标记法

 取一定量的细胞悬液（约1X106细胞／ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法

1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。

3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。

这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。

通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。

此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。

这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。

4．使用F（ab’）2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。

大多数的第二抗体的F（ab’）2片段容易利用。

而第一抗体的F（ab’）2片段一般是不能利用或很难制作。

因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。

在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。

5．其它：

已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。

为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

第二部分 细胞因子

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

一、简介

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。

在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。

目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：

ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limitingdilutionanalysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。

随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。

下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

　　早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。

尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－g）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。

近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。

因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。

在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。

这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。

在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。

且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。

胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。

具有其它方法难以比拟的优点：

Ø 快速：

流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；

Ø 简便：

无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；

Ø 灵敏度高：

高度灵敏的荧光标记与检测系统；

Ø 高效：

可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；

Ø 安全：

减少样本处理与生物源性污染

Ø 接近生物体的分析条件：

全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。

二、所需仪器

1. 流式上样管及细胞培养皿或板

2. 25%CO2，37℃孵箱

3. 混匀振荡器

4. 离心机

5. 加样器、Tips

6. 流式细胞仪

三、常用的标本类型和处理方法

全血：

使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。

如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

自身血浆中外周血单个核细胞（PBMCs）：

使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。

组织培养基中的外周血单个核细胞（PBMCs）：

用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。

细胞系与T细胞克隆：

调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。

冰冻全血与PBMCs：

使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。

溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

四、所需试剂

1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂

依据实验需要选择特殊表面标志

CD45圈定所有淋巴细胞

CD3圈定T淋巴细胞

CD4圈定T辅助淋巴细胞亚群

CD8圈定T抑制淋巴细胞亚群

CD19/或CD20圈定B淋巴细胞

CD56圈定NK淋巴细胞

CD14圈定单核细胞

2、荧光标记的细胞因子抗体：

R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体

3、溶血素：

用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞

4、激活剂

① Phorbol12-Myristate13Acetate（PMA）（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）

A. DMSO中调节浓度0.1mg/mL

B. 分装（20mL），－20℃储存。

勿反复冻融

C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：

100稀释储存液

D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液

② Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）

A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL

B. －20℃储存

C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：

10稀释储存液

D. Ionomycin终浓度1mg/mL细胞悬液

③ StaphylococcalenterotoxinB（SEB）（Sigma,CatalogNo.S-4881）

A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL

B. 4℃储存

C. SEB终浓度10mg/mL细胞悬液

④ CD3：

包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞

⑤ CD28：

加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml

5、阻断剂

阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内

①Brefeldin-A（BFA）（eBioscience，目录号00-4506）

A.于DMSO中调节浓度5mg/mL

B.分装（20mL），-20℃储存。

勿反复冻融。

C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：

10稀释储存液

D.激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mL细胞悬液。

注意：

BFA过度孵育会导致细胞活力下降

②Monensin（eBioscience，目录号00-4505）

6、不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、固定剂：

细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。

固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。

含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）

8、破膜剂：

含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）

将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合

9、其它试剂：

无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。

五、细胞培养和刺激的基本方法

细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。

下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。

表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法

检测细胞因子

阳性对照刺激方法

人IFN-γ

方法2（4-24小时）

人TIMP-1

方法5

人αTNF-

方法7（6小时）

人IL-1α

方法3（6小时）

人βIL-1

方法3（24小时）

人IL-2

方法2（4-24小时）

人IL-4

方法4

人IL-5

方法1

人IL-6

单核细胞：

方法3（6-12小时）T细胞：

方法6

人IL-10

方法1

人IL-12

方法8

人IL-15

方法3

人Fractalkine/CX3CL1

方法1

人IL-8/CXCL8

方法3（24小时）

人MCP-1/CCL2

方法3（24小时）

人MIP-1α/CCL3

方法3（24小时）

人MIP-1β/CCL4

方法3（24小时）

人RANTES/CCL5

方法1

小鼠IL-2

方法9

小鼠IL-4

方法10

小鼠IL-5

方法10

小鼠IL-6

方法11

小鼠γIFN

方法9or方法12

小鼠αTNF-

方法9

为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂（如3uMmonensin，10mg/ml的BFA）

方法1:

 只使用转染细胞检测

方法2:

人的PBMCs使用PMA（10ng/ml）和Ionomycin（1uM）刺激4-24小时.

方法3:

人的PBMC使用LPS（0.5-1ug/ml）刺激24小时.

方法4:

人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA（10ng/ml）和Ionomycin（1uM）刺激6小时

方法5:

CD4+T细胞使用PHA（10ng/ml）刺激4days

方法6:

T细胞使用抗CD3的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b（Lorre,etal.,1994,ClinImmunoImmunopath70:

1）

方法7:

使用PMA（50ng/ml）和Ionomycin（500ng/ml）刺激

方法8:

PBMCs细胞使用重组人IFNg（10ng/ml，目录号285-IF-100）刺激2小时，然后使用IFNg（10ng/ml）+LPS（1ug/ml）刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1细胞.

方法9:

EL4在包被抗小鼠CD3抗体（25ug/ml）的培养板中，使用抗CD28抗体（2ug/ml）+PMA（5ng/ml）+Ionomycin（500ng/ml）刺激6小时

方法10:

CD4＋T细胞在包被小鼠CD3（25ug/ml）抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28（2ug/ml）的抗体，重组小鼠的IL-2（10ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA（5ng/ml）、Ionomycin（500ng/ml）和monensin刺激6小时。

方法11:

小鼠ip巨噬细胞使用Mouseip1ug/mlLPS刺激24小时

方法12:

小鼠脾细胞使用PMA（5ng/ml）和Ionomycin（500ng/ml）刺激6小时

六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1、 收获细胞：

肝素钠抗凝的静脉血，按1：

1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书），混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时

2、 阻断Fc受体：

用于消除非特异性的结合染色

① 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

② 对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断

3、细胞表面染色

① 加适当的细胞表面染色试剂20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（细胞浓度维持在2×106/mL）混匀，室温暗处孵育15分钟；

② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。

（注意：

PMA激活的全血可能会溶血不完全。

）

③ 离心500g5分钟，弃上清

4、固定和破膜

① 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g5分钟，弃上清；

② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。

（剂量参照说明书）

③ 加2~3mLPBS洗液，离心500g5分钟，弃上清。

5、细胞内染色

① 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

② 加2~3mL洗液，离心500g5分钟，弃上清，加入500mLPBS上机或加入500mL1%PFA固定后再上机

七、注意事项

1. 标本处理：

避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。

此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。

血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。

如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2. 刺激激活：

检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。

比如，要检测IFN-γ