水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测.docx
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水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
(1)
录入时间:
2010-9-2511:
17:
29来源:
生物信息网
(一)实验目的
(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
(二)实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有:
水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水的微生物学的检验,特别是肠道细菌的检验,在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义,同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定,饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个,细菌总数每mL不超过100个。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数,所用的方法是稀释平板计数法,由于计算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit,cfu)数,故其单位应是cfu/g(mL)。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群,是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称,主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成,即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值,以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
在正常情况下,肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。
这些细菌都可随人畜排泄物进入水源,由于大肠菌群在肠道内数量最多,所以,水源中大肠菌群的数量,是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前,国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法,常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水,操作简单、快速,但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
(三)实验器材
(1)菌落总数的测定:
1)培养基:
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,无菌生理盐水。
2)器材:
灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定;
1)培养基:
①乳糖胆盐蛋白胨培养基:
蛋白胨20g,猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖10g,0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,水1000mL,pH7.4。
制法:
将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装,每瓶50mL或每管5mL,,并倒置放入一个杜氏小管,l15℃灭菌15min。
双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基:
除水以外,其余成分加倍或取三倍用量。
②伊红美蓝琼脂培养基:
蛋白胨10g,乳糖10g,K2HP042g,2%伊红水溶液20Ml,0.65%美蓝水溶液lOmL,琼脂17g,水1000mL,pH7.1。
制法:
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中,校正pH后分装.121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂,冷至50-55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板。
③乳糖发酵管:
除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
2)器材:
灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等。
四)实验方法
(1)水样的采集:
1)自来水:
先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2)池水、河水、湖水等地面水源水:
在距岸边5m处,取距水面10-15cm的深层水样,先将灭菌的具塞三角瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出。
如果不能在2h内检测的,需放入冰箱中保存。
(2)细菌总数的测定:
1)水样稀释及培养:
①按无菌操作法,将水样作10倍系列稀释:
⑦根据对水样污染情况的估计,选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等,一般选择1、1:
10两种浓度;水源水如河水等,比较清洁的可选择1:
10、1:
100、1:
1000三种稀释度;污染水—被选择1:
100、1:
1000、1:
10000三种稀释度),吸取1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿,每皿约15mL,并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后,将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2)计算方法:
作平板计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3)计数的报告:
①平板菌落数的选择:
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数。
如果一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。
若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
②稀释度的选择:
a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。
b.若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30-300之间,则视二者之比如何来决定。
若其比值小于2,应报告其平均数;若比值大于2,则报告其中较小的数字(l例2、例3)。
c.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。
d.若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。
e.若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(表1例6)。
f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间,则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。
③细菌总数的报告:
细菌的菌落数在l00以内时,按其实有数报告;大于100时,用二位有效数字,在二位有效数字后面的数字,以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的0的个数,可用10的指数来表示,如表1“报告方式”一栏所示。
(3)大肠菌群的测定(多管发酵法):
表1稀释度的选择及细菌数报告方式
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/(cfu/g或cfu/mL)
报告方式(菌落总数)/(cfu/mL或cfu/g)
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
-
16400
16000或1.6×104
2
多不可计
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
多不可计
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
多不可计
多不可计
313
-
313000
310000或3.1×105
5
27
11
5
-
270
270或
6
0
0
0
-
<10
<10
7
多不可计
305
12
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
(2)
录入时间:
2010-9-2511:
22:
11来源:
生物信息网
1)生活饮用水或食品生产用水的检验:
①初步发酵试验:
在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管),以无菌操作各加水样100mL。
在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管),以无菌操作各加入水样10mL。
如果饮用水的大肠菌群数变异不大,也可以接种3份100mL水样。
摇匀后,37℃培养24h。
②平板分离:
经24h培养后,将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶),分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上,37℃培养18—24h。
大肠菌群在EMB平板上,菌落呈紫黑色,具有或略带有或不带有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深;挑取符合上述特征的菌落进行涂片,革兰氏染色,镜检。
③复发酵试验:
将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中,为防止遗漏,每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个,37℃培养24h,如果产酸又产气者,即证实有大肠菌群存在。
④报告:
根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数,查表2(或表3),报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。
2)水源水的检验:
用于检验的水样量,应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。
①严重污染水:
1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。
②中度污染水:
10.1,0.1,0.01mL各1份。
③轻度污染水:
100,10,1,0.1mL各l份。
④大肠菌群变异不大的水源水:
10mLl0份。
表2大肠菌群检索表(饮用水)
0
1
2
备注
每升水样中大肠菌群数
0
<3
4
11
接种水样总量300mL(100mL2份,10mL10份)
1
3
8
18
2
7
13
27
3
11
18
38
4
14
24
52
5
18
30
70
6
22
36
92
7
27
43
120
8
31
51
161
9
36
60
230
10
40
69
>230
表3大肠菌群数变异不大的饮用水
阳性管数
0
1
2
3
接种水样总量300mL(3份100mL)
每升水样中大肠菌群数
<3
4
11
>18
表4大肠菌群检索表(严重污染水)
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
1
0.1
0.01
0.001
-
-
-
-
<900
接种水样总量为1.111(1,0.1,0.01,0.001mL各一份)
-
-
-
+
900
-
-
+
-
900
-
+
-
-
950
-
-
+
+
1800
-
+
-
+
1900
-
+
+
-
2200
+
-
-
-
2300
-
+
+
+
2800
+
-
-
+
9200
+
-
+
-
9400
+
-
+
+
18000
+
+
-
-
23000
+
+
-
+
96000
+
+
+
-
238000
+
+
+
+
>238000
表5大肠菌群检索表(中度污染水)
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
10
1
0.1
0.01
-
-
-
-
<90
接种水样总量为11.11(10,1,0.1,0.01mL各一份)
-
-
-
+
90
-
-
+
-
90
-
+
-
-
95
-
-
+
+
180
-
+
-
+
190
-
+
+
-
220
+
-
-
-
230
-
+
+
+
280
+
-
-
+
920
+
-
+
-
940
+
-
+
+
1800
+
+
-
-
2300
+
+
-
+
9600
+
+
+
-
23800
+
+
+
+
>23800
表6大肠菌群检索表(轻度污染水)
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
备注
100
10
1
0.1
-
-
-
-
<9
接种水样总量为111.1(100,10,1,0.1mL各一份)
-
-
-
+
9
-
-
+
-
9
-
+
-
-
9.5
-
-
+
+
18
-
+
-
+
19
-
+
+
-
22
+
-
-
-
23
-
+
+
+
28
+
-
-
+
92
+
-
+
-
94
+
-
+
+
180
+
+
-
-
230
+
+
-
+
960
+
+
+
-
2380
+
+
+
+
>2380
表7大肠菌群变异不大的水源水
阳性管数
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
每升水样中大肠菌群数
<10
11
22
36
51
69
92
120
160
230
>230
备注
接种水样总量100mL(10mL10份)
操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。
同时应注意,接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管;接种量在1mL以上者,应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。
然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数,查表4、表5、表6或表7,报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。
附:
滤膜法
滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中,经过抽滤,细菌即被均匀地截留在膜上,然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。
再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落,计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。
(1)准备工作:
1)滤膜灭菌:
将3号滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中蒸煮灭菌3次,每次15min。
前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次,以除去残留溶剂。
2)滤器灭菌:
准备容量为500mL的滤器,用点燃的酒精棉球火焰灭菌,也可用121℃高压灭菌20min。
3)培养:
将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。
(2)过滤水样:
1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上,轻轻地固定好滤器漏斗。
水样摇匀后,取333mL注入滤器中,加盖,打开滤器阀门,在—50kPa压力下进行抽滤。
2)水样滤完后再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用无菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴,两者间不得留有间隙或气泡。
若有气泡需用镊子轻轻压实,倒放在37℃培养箱内培养16-18h。
(3)结果判定:
1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色,镜检。
①紫红色,具有金属光泽的菌落。
②深红色,不带或略带金属光泽的菌落。
③淡红色,中心颜色较深的菌落。
2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌,需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基,37℃培养6-8h,产气者,则判定为大肠菌群阳性。
3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。
食品中细菌总数的测定
录入时间:
2010-9-2511:
26:
31来源:
生物信息网
一、目的与要求:
1 学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理
2 了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义
二、原理:
菌落总数是指食品经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。
三、 材料
1 食品检样
2 培养基
营养琼脂培养基,无菌生理盐水
3 其它
无菌培养皿,无菌移液管,无菌不锈钢勺。
四、流程、步骤
1 取样、稀释和培养
A 以无菌操作取检样25g(或ml),放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振要或研磨制成1:
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:
10的均匀稀释液。
B 用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:
100的稀释液。
C 另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。
D 根据标准要求或对污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在制作10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。
E 稀释液移入平皿后,将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。
F 待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。
2 菌落计数方法
作平皿菌落计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
在记下各平皿的菌落总数后,求出同稀释度的各平皿平均菌落数。
到达规定培养时间,应立即计数。
如果不能立即计数,应将平板放置于0-4℃,但不要超过24h。
3 菌落计数报告方法
A 平皿菌落数的选择
选取菌落数在30~300之间的平皿作为菌落总数测定标准。
每一个稀释度应采用两个平皿平均数,其中一个平皿有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平皿的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
B 稀释度的选择
a 应选取平均菌落数在30~300之间的稀释度报告。
b 若有二个稀释度均在30~300之间时,应以二者比值决定,比值≤2取平均数,比值>2则其较小数字。
c 若所有稀释度均>300,则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
d若所有稀释度均<30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。
e若所有稀释度均无菌落生长,则应按<1乘以最低稀释倍数报告之。
f若所有稀释度均不在30~300之间,有的>300,有的又<30,则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
C 菌落计数报告方法
菌落数在1~100时,按实有数字报告,如大于100时,则报告前面两位有效数字,第三位数按四舍五入计算,为了缩短数字后面的零数,也可以10的指数表示。
五、 结果
1 将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。
2 对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。
希瓦菌生物学特性的实验研究
录入时间:
2010-9-2511:
30:
31来源:
中国人兽共患病学报
基因分型技术的快速发展,为更准确地进行微生物学分类、临床快速鉴定细菌感染、了解病原菌的致病机制以及它们与宿主的关系提供了可能。
本文所阐述的希瓦菌属(Shewanella spp.)的分类,就是随着全基因测序研究而不断趋于完善的。
该菌的命名曾经历了原本归属于无色棒菌属(Achromobacter spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、异单胞菌属(Alteromonasspp.)也称交替单胞菌属(Rubescens spp.)、腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)几个阶段,最终命名为希瓦菌属(Shewanella spp.)。
1998年Shideh根据5SrRNA序列的同源性研究,对希瓦菌属进一步做了种、型的分类。
本文主要参照Shideh等报道的分类原则和方法,对分离来自腹泻病人粪便和外环境的13株希瓦菌,进行了生物学特性的实验研究,现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1 实验菌株 5株分离自腹泻病人的粪便,1株分离自病家附近的池塘水,1株分离自病人家苍蝇,6株分离自病家饲养的禽、畜粪便(其中猪粪2株、羊粪3株、鸡粪1株),共计13株。
1.2分离培养基 腹泻病人的菌株直接由麦康凯平板分离。
池塘水经EC肉汤增菌后,由麦康凯平板分离。
苍蝇和禽、畜粪便经含新生霉素的mEC肉汤36℃震荡培养6h,分离于CT—SMAC(头孢克肟、亚碲酸钾山梨醇麦康凯)平板。
1.3 希瓦菌属的鉴定 用bioMerieux公司的ATB半自动细菌鉴定仪-ID32 GN和Api20E及Api 20NE试条根据说明书进行鉴定。
1.4 腐败希瓦菌(Shewanella putrefaciens,SP)和海藻希瓦菌(Shewanella algae,SA)的鉴别用Hugh—Leifson O/F试验培养基,以观察其对糖、醇氧化分解的能力及在6.5%的盐胨水中和SS琼脂的生长情况和绵羊血琼脂上是否有溶血现象进行属内区分。
培养基购自市售的干燥培养基。
2 结 果
2.1菌体形态 13株希瓦菌,均为革兰阴性,无芽孢,直杆状或微弯曲的杆菌,大部分单个或偶有
短链状排列。
2.2生物学特性 该菌为需氧菌,糖代谢类型为氧化型。
对营养要求不高,在肉汤培养基中,经36℃培养3~6h呈均匀混浊,18~24h液面形成菌膜,继续延长时间后,则管底形成膜状物沉淀。
在pH8.4的碱性胨水中生长良好。
在半固体琼脂中显示有动力,表层菌苔呈淡粉红色,但色素不扩散,也不溶于乙醇及氯仿等有机溶剂。
在KIA琼脂中产生大量的硫化氢。
在麦康凯琼脂上,形成无色半透明光滑、淡橙色菌落。
在CT—SMAC琼脂上形成无色半透明中心略带淡灰色的菌落。
在SS琼脂上部分菌株被抑制,在绵羊血琼脂平板上大部分菌落不溶血。
2.3生化鉴定结果 根据美国CDC的生物学分类原则,并通过用传统的鉴定方法对13株不同来源的希瓦菌的生物学实验研究,结果其中9株为腐败希瓦菌,4株为海藻希瓦菌,详见表1。
使用微生物鉴定系统:
ATB-Expression的ID32GN试条及API20NE和20E同步进行鉴定,其鉴定结果均为腐败希瓦菌,符合率分别为94.7~99.9%,不能区分希瓦菌的不同种别。
2.4生物分型 在9株腐败希瓦菌中,生物1型6株,其特性为能氧化分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖,其中还有3株能分解阿拉伯糖,2株分解木糖。
在SS琼脂和6.5%氯化钠胨水中均不生长,在血琼脂平板上不溶血。
生物2型3株,突出特征是除能缓慢氧