CHRONOLOG 560Ca 中文手册注册用.docx

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CHRONOLOG560Ca中文手册注册用

CHRONO-LOG560Ca

全血血小板聚集分析系统

操

作

手

册

仅供体外诊断使用

用于检测全血或富血小板血浆的血小板聚集和ATP释放，另外可以检测钙离子流。

总括与说明—————————————————————————————１

血小板聚集实验的原理————————————————————————2

光学聚集法――—－—－—－—－—－—－—－—－—－—－—－—3

电阻法―――――――――――――――――――――――――――4

荧光ＡＴＰ释放法――――――――――――――――――――――4

系统特点——————————————————————————————5

电阻法―――――――————————————————————5

一般特点――――――――――――――――――――――――――5

操作说明—————————————————————————————6

　电阻法――――――――――――――――――――――――――――6

光学聚集法――――――――――――――――――――――――――9

荧光法（ATP释放）――――――――――――――――――――――――11

运行ＡＴＰ标准―――――――――――—————————————12

结果―――――――――――――――――――――――――――――――13

　电阻法―――――――――――――――――――――――――――13

　光学聚集法――――――――――――――――――――――――――13

荧光法（ATP释放）―――――――――――――――――――――――13

结果的解释―――――――――――――――――――――――――――14

筛选过程――――――――――――――――――――――――――――――16

　　　样本要求————————————————————————————16

　　　　全面的过程――――――――――――――――――――――――——19

离子钙，形状改变和在含发光物质的血小板中的聚集―――――――31

药物干扰―――――――――――――――――――――――――――――――35

危险性―――――――――――――――――――――――――――――――35

保养与服务―――――――――――――――――――――――――――――36

电子探针组件――――――――――――――――――36

光路与隔膜―――――――――――――――――――36

自动定标过程――――――――――――――――――――――――――――37

典型聚集释放曲线――――――――――――――――――――――――――附录Ａ

总括与说明

血管损伤后，血小板粘附于血管的损伤处，聚集、合成前列腺素，释放5-羟色氨、ADP、ATP。

前列腺素的合成与释放产物会引起更进一步的聚集。

同时血浆凝固开始、凝血酶产生、纤维蛋白形成和血小板栓子堵塞损伤的血管。

由于细胞膜糖蛋白、细胞内储存颗粒、血小板酶、血浆凝血因子缺乏常引起过量出血，人临床表现为：

鼻衄、损伤、擦伤失血过多。

另外,外科手术的患者尽管经常存在血小板功能障碍,但直到出血不止、或术后出血不止才能发现．

在1962年,Born描述了用ADP诱导的血小板聚集并改革用比浊计测量富血小板血浆的聚集过程.这种改变包括:

预温37度,搅拌和用记录笔记录一定时间内透过光的变化.

在1977年，Feinman设计了一台仪器,同时测量血小板聚集和ATP释放。

这台仪器利用紫外光测量聚集,在聚集光路的右侧放置敏感的光度计，通过荧光的产生测量ATP的释放.

在1980年，Cardinal和Flower设计了电阻法测量全血中的聚集,非常小的电流通过两个电极,当电极刚与血接触时,在其表面会附着一层血小板,当聚集剂加入后,更多的血小板会聚集在其表面,引起电阻增加。

电阻法的测量和荧光的测量又构成了一台全血荧光聚集仪。

在1984年，Wojenski和Sliver发现了一种快速的方法去进行常规实验室的操作。

这种方法就是同时测量聚集和ATP的释放,用血量为5毫升,30分钟内完成检测。

这种方法避免富血小板血浆的准备时间。

在1985年Johnson创造了一种方法去检测洗涤血小板的钙流,这种方法有利于研究钙离子在血小板聚集中的作用。

参考文献

血小板聚集实验的原理

众所周知，血小板必须在一系列条件和不同试剂存在的情况下才能发生聚集。

“血小板聚集”是一个术语，用来表示血小板与血小板之间的粘附。

在全血或富血小板血浆中加入致聚剂，这种现象能被诱发。

血小板的聚集有赖于钙离子、纤维蛋白原、单个或多个的血浆因子和致聚剂的存在。

使用不同种类和浓度的致聚剂，血小板的聚集也有不同的变化。

比如光学法，ADP、肾上腺素、胶原、和瑞斯托霉素被广泛应用于监测和提供最快速的基本诊断信息。

这些试剂的选择有其理论依据：

ADP和肾上腺素都包含在血小板的储存颗粒中，它们在原始血栓形成时释放出来并诱发进一步的血小板聚集。

所以体外的血小板和致聚剂的反应被证明有助于确定出血性疾病的病因。

另一方面，胶原虽然在血管的结缔组织中而不在血小板中。

但血管损伤后它被认为是第一个聚集或凝固前因子。

因此，胶原血小板的体外实验也是非常重要的。

其他试剂如凝血酶、瑞斯托霉素、钙离子载A23187、花生四烯酸、凝血因子VIII、血清胺也被用于血小板实验。

血小板聚集实验是目前最有用的血小板功能体外诊断实验。

它能提供其他技术不可能或很难得到的结果，帮助疾病的诊断以及治疗措施的合理选择。

这项实验累积起来的经验描绘了先天和获得性血小板功能障碍的图谱。

血小板聚集实验的临床意义是获得性或类似性质的血小板功能缺陷的检测和诊断。

加入特定的聚集试剂后，血小板是否聚集是区别不同类型的血小板功能障碍的依据。

如下表所示：

血小板功能缺陷聚集的研究

缺陷

ADP诱导聚集

胶原诱导聚集

瑞氏托酶素诱导聚集

血小板无力症

减少

减少

正常

血小板减少症

正常（1期）

减少

正常

假性血友病

正常

正常

异常

非类固醇抗炎药

正常（1期）

减少

异常

三种类型的聚集实验:

⏹PRP中的光学聚集法

⏹全血中的电阻法

⏹ATP释放（荧光）的检测

光学聚集法

血小板的体外聚集可以反映血小板在体内形成初始凝血块的能力。

血浆悬液中的血小板通过相对低离心力的离心从经过抗凝处理的血液样本中分离。

离心的产物称为富血小板血浆（PRP）。

贫血小板血浆（PPP）的制备是通过血液样本的相对高速离心得到的。

Born型聚集仪或光学聚集仪是一个带有一个（或多个）加热到37摄氏度样品室的固定波长的分光光度计。

同时进行持续的样品搅拌，因为在血小板和血小板的接触是决定血小板体外聚集的必要因素。

Chrono-log的样品室设计可以使一束红外线同时通过两个比色杯，一个盛有PRP（样品）另一个盛有PPP（对照）。

硅photodiodes检测可以通过样品的光线：

认为ＰＲＰ的透光率是０％或者说是０％聚集；认为ＰＰＰ的透光率是１００％或者说是１００％聚集。

Photodiodes检测到的透光率的变化量转化为仪器的记录。

双孔双红外线束的设计确保了重复性，并允许同时测量聚集和荧光。

每个通道有一个分离的孔用于检测（ＰＲＰ或洗脱的血小板；０％透光率）和校正对照（ＰＰＰ或缓冲液；１００％透光率）样品。

光学聚集量和持续测量的检测样本和对照样本的透光率变化是成比例的。

揿下按钮设置好０％和１００％透光率的基线。

高灵敏度的双孔双光束的检测系统，在检测样本和对照样本之间仅需３０＊１０９的差异数即可检测。

如果样本不足以进行精确的检测，聚集输出量将在两条基线检测持续循环以警告操作者。

当血小板对刺激物（兴奋剂；聚集剂）产生应答而发生变形时，其变大的体积使PRP的透光率降低：

这将记录为样本的透光率相对于PPP降低。

如果聚集剂的剂量足够大可以引起血小板之间的黏附而形成聚集，越来越多的光线可以通过PRP样本。

透光随时间的改变被记录下来，其变化趋向于贫血小板血浆，即达到100%的透光率。

体外聚集记录表达的含义：

✓形状变化

✓第一波聚集（原始聚集），可能先背离PRP基线后再回到PRP基线。

✓不可逆的第二波聚集，发生在血小板未知颗粒成分变为刺激物并引发额外的聚集。

聚集曲线还可以表明：

✓刺激物（聚集百分比）引起的透光率变化的最大值。

✓聚集的范围或速率，每分钟的聚集百分比变化

复合聚集剂和配剂常用于血小板刺激。

不同的聚集剂刺激血小板聚集的不同途径。

不同浓度的兴奋剂可以引出一系列曲线（剂量应答曲线）。

这些检测组的应答模式与已建立好正常模式和异常模式做比较。

普遍认为这些信息与血小板凝血功能成分有关。

全血中的电阻法

血小板的体外聚集可以反映血小板在体内形成初始凝血块的能力。

在抗凝血液中检测血小板，无需从血液中的其他组分中进行血小板分离。

由于不需要标本离心来得到光学上的透明细胞悬液，因而可以检测完整的血小板群体。

减少检测过程的耗时；血液中有形成分对血小板的影响也能表现出来。

全血血小板聚集仪，要求样本加热到37度。

要准备可重复使用的搅拌子后一次性搅拌子。

将搅拌子和样本一起放到检测杯中。

阻抗法聚集与光学法不同。

电极要放到检测杯中用于检测。

电极有两金属线。

仪器检测电极两个电线间的阻抗，而得到结果。

在重要的平衡过程中，血小板以单层的形势在金属线暴露的部分，有一个稳定的阻抗值。

这个阻抗值为0ohm时的值。

当加入聚集试剂后，血小板聚集并包裹到金属线上。

会增加电路中的阻抗值。

电路中阻抗的变化用ohm显示。

加入试剂后仪器通常运行4-6分钟。

电阻法的结果通常以下面的方式表示；

在测试过程中的ohm

每分钟ohm的改变，即斜率。

最大聚集率。

阻抗的变化直接表明血小板聚集的数量。

瑞斯脱酶素诱导的聚集全血阻抗法较敏感。

ATP释放（荧光）的检测

ATP的释放用的荧光检测方法。

发光物的测量师是很简单的测量原理。

但是大多数的可见光波长很并且很稳定，要求聚集检测过程中的检测杯的透光度要好。

后来都用荧光来检测，避免了可见光的干扰。

通过加CHRONO-LUME试剂增强光通道对荧光的敏感。

CHRONO可同时检测血小板聚集和ATP的释放。

光学法检测聚集通过光路的变化在纪录曲线的改变。

阻抗法可测全血或PRP。

系统特点

电阻法

Ø电极探针：

有２根精密的金属丝组成．探针有根足够长的电线，保证在水或生理盐水的清洗过程中能得到简单的清洁

Ø标本量：

总计１ml，其中有450ul血．450ul生理盐水，100ulCHRONO-LUME试剂

Ø反应杯：

普通塑料P/N367

Ø搅拌磁棒：

Ｔeflon涂层P/N368P/N367

Ø搅拌磁棒：

disposablesiliconizdedP/N370

系统的一般特点

Ø搅拌速度:

crystal控制前方面板,每个通道能在OFF到1200RPM之间以100RPM为一个单位调节误差+/-1.0%

Ø温度:

加热模块37℃+/-0.2℃,电子控制,前方面板显示.另外可选购测定环境温度的组件.

Ø孵育位:

36.5℃+/-1.0℃下,使用1ml反应杯,每个通道6个孵育位.

Ø电气要求:

115或230V

标本收集

标本要求（全血）

样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。

常用的诱导剂除了肾上腺素.血液标本用3.2或3.8的柠檬酸钠1:

9抗凝。

1份抗凝剂9份全血。

样本必须用含标准抗凝剂的真空无菌管收集。

测试肾上腺素的血液标本抗凝剂要求：

在每毫升1.5%的柠檬酸钠中加2U/ML的HEP混合做抗凝剂。

取1份抗凝剂9份全血。

样本收集不需要禁食，但不能做剧烈运动。

不能吸烟。

检测前10天或2周禁止服用影响血小板功能药物。

药物对血小板功能的影响在药物影响一章中有详细说明。

样本收集完毕应该立即检测。

三小时内必须检测完毕。

样本应保存在室温。

（24℃-27℃）

标本要求（富血小板血浆）

样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。

血液标本用3.2或3.8的柠檬酸钠1:

9抗凝。

1份抗凝剂9份全血。

标本收集时为了不让血小板激活。

用塑料试管或硅化的玻璃管。

标本采集前，不能做剧烈运动。

不能吸烟。

检测前10天或2周禁止服用影响血小板功能药物。

药物对血小板功能的影响在药物影响一章中有详细说明。

标本采集完30分钟就可以用于测试，2.5小时完成实验。

样本应保存在室温。

（24℃-27℃）

血浆的准备

1、用颠倒浑匀的方式混合标本，不要使劲摇晃。

2、制备富血小板血浆：

用100克的离心力15分钟，离心标本。

用移液枪吸取PRP放到塑料试管中。

试管上标明病人姓名、标本类型。

3、制备贫血小板血浆：

用2400克的离心力20分钟，离心标本。

用移液枪吸取PRP放到塑料试管中。

试管上标明病人姓名、标本类型。

操作说明

电阻聚集法

可使用全血、稀释血、富血小板血浆、乏血小板血浆。

标本收集

参见本手册标本收集一章

操作

质控和血标本可以平行测定。

以下过程采用的是单通道仪器。

每个孵育孔内要放置一个干净的含1ml生理盐水的反应杯，以便干净的探针能接触到，不用时保持反应杯的温度。

当孵育孔准备好时，放入新反应杯和搅拌磁棒。

开始预热。

注意：

预热一个标本的同时测定另一个标本，将缩短实验时间。

打开开关，等待聚集仪温度显示到37℃。

1）放入5个P/N367反应杯至孵育孔中。

2）每个反应杯都放入P/N370或者P/N368搅拌磁棒

3）预热反应杯10分钟。

4）吸取1ml标本到一个已经预热的反应杯中

如果测定的是稀释血液，请准备大量的稀释血和无菌等张盐水。

或者，在加入血之前，吸取所需的无菌等张盐水到反应杯里预热。

总量要达到1ml.。

警告：

生理盐水稀释全血时，必须使用不含防腐剂的盐水。

许多试剂纯的等张生理盐水和一些灌注液、浸液含有诸如苯甲醇之类的抑制血小板聚集和分泌的防腐剂。

诊断用途的典型的稀释度为1：

2（1份血，1份盐水）。

其他用途的，血可能要稀释到1：

10（1份血，9份盐水）。

5）选择Small/Large/Impedance滑动开关上的Impendance档。

6）预热孵育孔内的标本5分钟

7）打开加热盖，放入含有标本和搅拌磁棒的反应杯。

8）选择需要的搅拌速度，建议1000或者1200rpm

9）将电极探针装配并连接好.560CA在预热孔的前面.而500CA在预热孔的左边.

10）用金属线将电极探针缠绕完整.将金属线放在探针的后面,将加热块的盖子关闭完全.

11）拿下记录笔.打开记录仪

12）用“Zeroknob”点，让红色的阻抗取图表中央点。

顺时针旋转“Indepancezeroknob”使红色的阻抗笔移动到右边。

逆时针则到左边。

13）温电极，样本会减少其阻抗值让红色的阻抗笔向左移动。

当红色的阻抗笔停止向左移动时，证明电极何比色杯达到了需要的37℃。

如果红色的阻抗笔走到了图表的

外面。

用“Impendancezeroknob”从新复位。

14）用聚集仪上的“Impendancezeroknob”将红色的阻抗笔调到最初的纪录。

左边的10（或90）。

15）仪器记录两分钟。

以确认基线已经建立。

如果曲线往左移动说明样本仍在预温。

用“Impendancezeroknob”根据需要从设置基线。

注意：

如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。

更换样本或检查自发聚集产生的原因。

16）按住聚集仪上的定标按钮，仪器会自动产生标准20ohm的环形阻抗。

让红色的阻抗笔往右移动。

同时，另一个手用聚集仪上的“impendancegainknob”在表格中的基线上标记50。

这个步骤标定仪器在标准20ohm的阻抗下，记录笔移动40个小方格。

顺时针旋转“impedanceknob”将加快纪录笔的移动速度，逆时针将降低其移动速度。

17）打开加热块盖，加CHRONO-PAR试剂到样本中。

可用P/N388或353微量加样器。

注意：

每个试验的试剂用量很少。

加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。

应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。

最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。

将需要的试剂留下。

用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的加入试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。

移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。

做每个试验都要更换microbore

每天的试验完成后都要丢掉microbore。

为了保护plunger更换一个干净的microbore。

18）关闭加热块盖子，仪器纪录反应时间内的曲线。

1-6分钟。

19）试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。

20）打开加热块盖子，从样本中取走电极。

如果用的是P/N370一次性搅拌子,扔掉检测杯和搅拌子,如果用的是P/N368可重复使用的搅拌子,用P/N362搅拌子磁棒回收,扔掉检测杯.

用蒸馏水以搅拌的方式清洗电极.将电极上的聚集物取走.用生理盐水冲洗并用”KIMPWIPES”檫干电极,放到下一个样本中由于检测.

注意:

用KIMPWIPES檫干电极时,不能再电极上留下丝状物.

如果不是连续检测样本,将电极放在有生理盐水的检测杯中,并将其放在预温孔备用.

最后一个试验完成后,用流动水清洗电极,檫干并放在一个清洁\干燥的检测杯中.

如果没有纤维样物质.就没必要用含腐蚀剂的化学试剂来清洗电极.因为这些化学试剂会破坏电极表面的绝缘体,而导致电极不能做出基线.损坏的电极无法修理,必须从新更换.单通道500-CAP/N369电极。

双通道560-CAP/N369电极.

如果要对电极进行消毒,将家用消毒剂1:

10倍稀释后,清洁10秒,然后用蒸馏水清洗干净即可.

结果

结果通常以试剂加入后在反应时间内的OHM的变化来表示或以测试过程中的最大聚集率表示.

如果IMPEDANCEGAIN已经设置好．那么４０个小方格代表２０OHM．

　　　　每个大方格是５个OHM

　　　　每个小方格市０．５个OHM

曲线反应部分的切线为斜率．与１分钟的反应建立一个三角形．其高为一分钟的聚集率．根据表格可以直接判断出结果和最恰当的OHM．

光学法聚集

用于血小板含量丰富血浆和洗涤血小板的检测．

样本收集

样本收集在样本收集中有详细描述．

操作

1）打开聚集仪和记录仪电源，等待仪器温度上升到３７℃．

2）用Small/large/inpedance开关选择大／小反应位．

小位置用P/N3１２　５００ul检测杯．用P/N382insertassembly，将p/n382放到加热块中的样本检测孔．当用p/n3１２比色杯和p/n382检测时，必须将p/n３６５隔离物放到检测杯下面，使样本的体积增加２５０ul．

注意：

每个仪器都有其相匹配的p/n382．每个通道都有双样本模式．再insertassembly下面有仪器型号和通道数的明确标注．如果原始的insertassembly被更换，那么仪器通道与insertassembly必须有专业工程师从新配置．

　　大位置用１ml　p/n367比色杯／

　3）将选择好的检测放到预温孔，预热５分钟．

　　4）加p/n3１３搅拌子（可重复使用）到p/n3１２检测杯

　　5）加５００ul样本到p/n3１２检测杯．或加２５０ul样本到比底部有p/n3６５的p/n3１２检测杯．

　　6）加５００ul参比到p/n3１２检测杯（PPP或缓冲液）

　　7）打开加热块盖子将样本放到PRP检测孔．将参比物放到PPP检测孔．

8）关闭预热块盖子．

9）选择需要的搅拌速度１０００—１２００rpm

10）放下纪录笔。

打开纪录仪。

11）按住“baseline”钮。

聚集仪上的（lowerred）笔会从纪录纸上的左边从１０到９０。

自动设置１００％的基线。

12）放开“baseline”钮。

聚集仪上的（lowerred）笔会从纪录纸上的右边从１０到９０。

自动设置０％的基线。

如果聚集仪上的笔（lowerred）在表格上的基线中来回移动，可能有以下几个原因。

　１、样本杯和参笔杯位置放错。

　　　２、样本中血小板的数量小于３０＊１０９／l

3、检测杯没有放好。

　等待足够长的时间，确保０％的基线已经建立完成。

注意:

如果曲线往右移动，表明样本内有自身凝集，丢弃并更换样本，

调查发生自身凝集的原因。

　　　13）打开加热块盖子，用p/n３８８或３５３微量加样枪加入CHRONO-PAR试剂。

注意：

每个试验的试剂用量很少。

加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。

应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。

最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。

将需要的试剂留下。

用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的加入试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。

移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。

做每个试验都要更换microbore

每天的试验完成后都要丢掉microbore。

为了保护plunger更换一个干净的microbor

14）关闭加热块盖子，仪器纪录反应时间内的曲线。

1-6分钟。

　　15）试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。

16）打开加热块盖子，从样本中取走电极。

如果用的是P/N３１３可重复使用的搅拌子,用P/N362搅拌子磁棒回收,扔掉检测杯.

　　将参比留作下一个标本检测时用。

或者仍掉

结果：

　结果通常用聚集率和斜率表示

在光学系统的自动设置表格中显示，１００％聚集等于８个大方格：

　那么：

每个大方格表示的聚集率为１２．５％

　　　　每个小方格表示的聚集率为１．２５％

　根据纪录的表格可直接确定结果并报告出完整的报告。

再取曲线速度最快的点作出切线，就可以得到斜率，根据１分钟的反应建立一个三角形。

三角形的高即为１分钟内血小板的聚集率的改变。

用斜率的形势表现出来

　每个大方格每分钟的聚集率为１２．５％

　每个小方格每分钟的聚集率为１．２５％

发光物的检测（ATP释放反应）

可用于全血、稀释血浆、PRP和洗涤血小板的检测。

打开光电倍增管的电源时，只要关掉加热快的盖子，发光的强度就能被检测出来。

除非加入CHRONO-LUME试剂光的信号不会改变。

在运行实验前应运行标准。

发光物的检测过程与前面的光学法聚集和阻抗法聚集一样，除了下面几项例外：

检测前加试剂时，加样要块。

样本检测前有以下几个步骤：

1、阻抗法加全血或稀释血浆９００ul到P/N３６７检测杯。

后加１００ul试剂。

2、阻抗法作PRP或洗涤血小板时，加９５０UL到P/N３６７检测杯，后加５０UL　CHRONO-LUME试剂。

3、光学法聚集做PRP或洗涤血小板时，加４７５ul到P/N３１２，后加２５ulCHRONO-LUME试剂

4、光学法聚集，在P/N３１２检测杯下面放一个P/N３６５的橡皮垫，做PRP或洗涤血小板时，加２３８ul样本，后加１２ul　CHRONO-LUME试剂

做ATP试验前，必须先做标准。

ATP标准的定标使发光物的检测以nm的形式报告。

ATP标准的运行：

将P/N３６７检测杯放到预温孔。

加P/N３７０一次性