第1章抗体分子标记技术.docx

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第1章抗体分子标记技术

第1章抗体分子标记技术

第一节抗体的I125标记法

基本原理

有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。

当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。

蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。

在应用氯胺T（ChloramineT）法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α,6α-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。

该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。

试剂及仪器

●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体

●0.5mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.5（配法见附录1）

●无载体的Na125I3.7GBq/ml（100mCi/ml）的NaOH液

●凝胶过滤柱

●γ-记数器

●100g/L三氯醋酸

●70%乙醇

●玻璃纤维滤

●氯胺T（ChloramineT）反应用

*新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的0.5mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）；

*氯胺T反应终止缓冲液：

2.4mg/ml偏重亚硫酸，10mg/ml酪氨酸,10%甘油,1g/LXyenecyanol的PBS液。

操作步骤

*注意：

125I对健康有害，需要保护措施。

在应用125I应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。

（一）氯胺T法

1．用1.5mlEpendof管，加10μl抗体及pH7.5的0.5mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl；

2．加500μCi的Na125I，混匀；

3．加25μl2mg/ml氯胺T液，混匀；

4．在室温下培养1分钟；

5．加入50μl氯胺T反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的Na125I）；

6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。

将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。

应用γ-记数器监测各组分；

7．收集、合并含碘化抗体的各管；

8．将125I标记的抗体管放入同位素保护管中，置4℃保存。

（二）Iodogen-包被试管法

1.Iodogen以0.5μg/ml溶于氯仿；

2.将100μlIodogen液移入合用的玻璃试管中；

3.试管置通风橱中过夜，在室温下让氯仿蒸发；

4.加入50μl抗体（0.2-1mg/ml在pH7.5的0.5mol/L磷酸钠缓冲液中）；

5.加500μCiNa125I到加有抗体的Iodogen-包被管中，室温保温2分钟；

6.将管中反应液转入1.5mlEppendof管（其中已先加有50μlIodogen反应终止缓冲液），轻混；

7.通过凝胶过滤层析，将碘化抗体与碘化酪氨酸分离（同前络胺T法）；

8.收集、混合含碘化抗体的各管；

9.将125I标记的抗体置同位素保护管中，放4℃保存。

实验质量监测

应用三氯醋酸沉淀法测定抗体标记效率：

1．取两片玻璃纤维滤纸，用软铅笔写标记；

2．将滤纸平放在试管架的孔部，使其中心部分不接触试管架；

3．将1-5μl含约10000cpm的样品，准确的点到每一张滤纸的中心，在室温下待干；

4．用平头镊子将一滤纸转入试管，加入2ml100g/L三氯醋酸；

5．滤纸在三氯醋酸液中浸转10分钟，倾出溶液；

6．再加入2ml100g/L三氯醋酸，重复上述操作；

7．加入2ml70%乙醇，滤纸浸在乙醇中转动10分钟后，倾出溶液；

8．测定经过洗过涤与未洗涤滤纸的放射性；

9．由所测定滤纸点样中与抗体结合的125I量，计算与抗体液中与抗体结合的125I总量。

洗后滤纸的cpm

未洗滤纸的cpm×100=结合碘的比率

样品的总量/收集的分量×在洗后滤纸中的cpm=总抗体-结合放射性

*与抗体结合的同位素量应为样品中同位素总量的70-95%。

实验要点及说明

1．用氯胺T法进行碘化，也可在大约pH7.0的缓冲液中进行。

均必需保证反应体系中无还原剂存在。

2．如果氧化反应损伤蛋白质，可将氯抗体与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联）胺T量减少到0.02mg/ml,并将偏重亚硫酸液的浓度降到0.024mg/ml。

3．Iodogen-包被的试管可在干燥器中，室温下，保存多年。

4．125I标记的抗体，在制备后六周内均可使用（125I的半衰期为59.6天）。

5．要注意保证所用的Na125I是新鲜的，陈旧制剂的比活性低。

6．酪氨酸的碘化偶尔会对抗原的抗体结合位点有干扰，因此降低其结合能力，但这种情况很少见。

*以上同位素标记方法中需用高度纯化的抗体，以保证结果的可靠。

参考文献

1．Fraker,PL.andSpeck,JC（1978）Proteinandcellmembraneiodinationwithsparkinglysolublechloramines,1，3，4，6-tetrachloro-3α,6α-diphenyl-glucoluril.Biochem.Biophys.Res.Commun.80,849-857.

2．Greenwood,FC.,Hunter,WM.AndGlover,JS.（1963）Thepreparationof125I-labeledhumangrowthhormoneofhighspecificradioactivity.J.Biochem.89,114-123.

3．孙册，朱正美及顾天爵放射性标记凝集素《糖复合物生化研究技术》浙江大学出版社1999pp.501-504

（朱正美）

抗体的酶标记法

基本原理

本法是应用偶联剂使酶与抗体结合。

即通过应用单、双或多功能基试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶－抗体偶联复合物。

不同的酶-抗体复合物制备方法中，最广泛应用的是第一步加入戊二醛的方法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。

试剂及仪器

●亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体（5mg/mlPBS液或0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8）

●用以标记的酶（EIA级，有商品供应）：

辣根过氧化物酶（HRP,纯度为A430/A275>3），黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶（AKP），或大肠干菌β－D－半乳糖苷酶均可选用，但以HRP最为常用。

●2５％戊二醛液（电镜级）

●０.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）

●PBS（见附录）

●2mol/L甘氨酸液

●蒸溜甘油

●透析袋（分子量6000-8000）

●电磁搅拌器和搅拌棒

操作步骤

一．抗体与过氧化物酶偶联

1．将5mg抗体与10mg酶在总体积1ml的0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；

2．在4℃对0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）透析过夜；

3．用0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）稀释戊二醛至1%；

4．向透析混合液中加入50μl稀释过的戊二醛，在室温下轻1轻搅拌三小时；

5．加入2mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1mol/L，混合液室温放置2小时，以封闭残存的醛基

6．混合液在4℃对PBS透析过夜；

7．10000×g4℃离心30分；

8．将上清移入另一管中，按体积1：

1加入甘油，使终浓度达50%；

9．置-20℃保存。

二．抗体与AKP偶联

1．将5mg抗体与10mg酶在总体积2ml的0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；

2．其它操作同HRP标记法。

三．抗体与葡萄糖氧化酶偶联

按HRP偶联法操作，仅加入的1%戊二醛改为150μl。

四．抗体与β－D－半乳糖苷酶偶联

按HRP偶联法操作，但见偶联反应总体积改为2ml，１%戊二醛用量改为的100μl。

反应质量测定

可用抗原包被的微量板通过直接酶免疫试验测定偶联度。

（具体方法见-----）

实验要点及说明

1．如果参与偶联的氨基位于抗体和抗原的结合位点，则在偶联反应中，被标记抗体的亲和性能会不同程度的受到破坏；

2．主要影响偶联成功率的原因是在反应混合液中有游离氨基存在，游离氨基容易和戊二醛反应，因而干扰蛋白质的交连。

因此，必须用绝对不含有机物的水配置缓冲液，并且反应混合液要在偶联前对该缓冲液充分透析，是反应成功的要点。

3．反应不能应用Tris-甘氨酸缓冲液。

参考文献

1．Avrameas,S.（1969）Couplingofenzymestoproteinwithglutaraldehyde.Useoftheconjugatesforthedetectionofantigensandantibody.Immunochemistry5,43-52

2．Avrameas,S.andTernyck,T.（1971）PeroxidaselabelledantibodyandFabcongugateswithenhancedintracellularpenetration.Immunochemistry.8（12）:

1175-1179

（朱正美）

第三节抗体的生物素化标记

基本原理

本法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。

其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。

小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础。

试剂及仪器

●NHSB：

N-羟基琥珀酰亚胺生物素（有商品供应）

●0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液，pH8.0（见附录）

●双蒸水（注意去除游离氨基），用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液

●DMSO（二甲亚砜，有毒试剂）

●1mol/LNH4Cl

●叠氮钠（有毒试剂）

●PBS（见附录）

●10g/L牛血清白蛋白（W/W）PBS液

●分子筛柱（如G25）

●电磁搅拌器

●透析袋（MWCO8000）

●铝铂

●微量移液器

操作步骤

1．将待生物素化的蛋白质用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH8.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH8.6）稀释到1mg/ml,一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml;

2．交互用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH8.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH8.6），对蛋白质充分透析；

3．用1mlDMSO溶解NHSB1mg；

4．向1ml蛋白质溶液（即含蛋白质1mg）加入120μlNHSB溶液（即含NHSB120μg）；

5．在室温下持续搅拌，保温2-4小时；

6．加入9.6μL1mol/LNH4Cl（每25μgNHSB加1μl），在室温下搅拌10分钟；

7．在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；

8．将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1-3ml之间洗下；

9．最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.5g/L）及1.0g/LBSA。

将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50%重蒸甘油，置―20℃保存。

质量监测

与酶-或荧光染料-结合的亲和素、链霉亲和素或中和亲和素（neutravidin），通过标准方法（Westernblotting或免疫荧光染色法）测定交联率。

实验要点及说明

1．如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，会抑制标记反应。

因此，蛋白质在反应前要对0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L硼酸缓冲液充分透析；

2．所用的NHSB及待生物素化蛋白质之间的分子比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同，选择不当则影响标记的效率，应先用几个不同的分子比来筛选最适条件；

3．用NHSB量过量也是不利的，抗原的结合位点可能因此被封闭，导致抗体失活；

4．由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此时可加入去污剂如TritonX-100,Tween20等。

5．当游离ε-氨基（赖氨酸残基的氨基）存在于抗体的抗原结合位点时，或位于酶的催化位点时，生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性。

此时，应试用其它交联方法；

6．生物素还可能与不同的功能基团，如羰基、氨基、巯基、异咪唑基及苯酚基，也可与糖基共价结合（详见参考文献1）；

7．交联反应后，应充分透析，否则，残余的生物素会对生物素化抗体与亲和素的结合产生竞争作用；

8．在细胞的荧光标记实验中，中和亲和素的本底低，但由于链霉亲和素含有少量正电荷，故对某些细胞可导致高本底。

参考文献

1．Bayer,EA.AndWilchek,M.（1980）Theuseofavidin-biotincomplexasatoolinmolecularbiology.Meth.Biochem.Anal.26,1-45.

2．Guesdon,JL.,Ternynck,T.AndAvrameas,S.（1979）Thruseofavidin-biotininteractionofimmuenzymatictechniques.J.Histochem.Cytochem.27,1131-1139.

（朱正美）

第四节抗体的荧光标记法

基本原理

许多蛋白质分子在其表面含有较多的赖氨酸残基。

这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC（其激发波长为492nm,发射光波长为525nm）共价结合。

与FITC结合的抗体可用为特异性的探针，以测定细胞相应抗原的存在。

FITC具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值,0.85），而且形成的偶联物的稳定性很好。

FITC是应用最广的荧光染料，流式细胞仪就按FITC的特性，设计了激光波长为488nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm）。

偶联反应是在pH9.8条件下，赖氨酸残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应，由此形成硫脲连接。

试剂及仪器

●待偶联抗体

●碳酸氢钠缓冲液：

25mmol/LNa2CO3/NaHCO3缓冲液pH9.8（新鲜配制，配法见附录）

●PBS（见附录）

●叠氮钠（有毒试剂）

●异硫氰酸荧光素（I型异购体，有商品供应）

●电磁搅拌器

●铝铂

操作步骤

1．用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；

2．将透析袋放入100ml含0.1mg/mlFITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光，4℃搅拌过夜；

3．上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。

其间至少更换PBS液三次，直致480nm的吸收为零；

4．加入0.5g/L的叠氮钠。

此后，结合物在4℃避光保存，或分装后在－2０℃冻存。

荧光偶联质量的检测

用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。

或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定：

取结合物液0.2ml，加PBS2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，查FITC标志曲线得其浓度μg/ml值，按IgG的消光系数（mg/ml约A2801.2）,可计算其F/P值，即每mg抗体所标记的μgFITC的比值，可以此鉴定及比较各批标记物的质量。

实验要点及说明

1．偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；

2．要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）；

3．FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。

此比值的范围应为０.3－１.0（方法见前）；

4．FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；

5．如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰；

6．如果被标记的蛋白质是第二抗体或通用的第一抗体，则从商品购置可能更方便可取。

参考文献

1．The,THandFeltkamp,TEW.（1970）Conjugationoffluoresceinisothiocyanatetoantobodies.I.Experimentsontheconditionsofconjugation.Immunology18,865-873.

2．The,THandFeltkamp,TEW.（1970）Conjugationoffluoresceinisothiocyanatetoantobodies.II.Areproduciblemethod.Immunology18,875-881

（朱正美）

第五节生物合成过程的标记

基本原理

对生物合成过程进行标记，主要是为了研究蛋白质的生化性质、合成、加工、细胞内传送、分泌和降解过程。

通常将细胞放在含有充足营养成分和放射性标记氨基酸的培养基中，虽然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白质中的含量较低，但其35S标记物具有特异性高（>2.93×1013Bq/mmol）、容易检测的特点，因此是进行生物合成标记的首选氨基酸。

下列步骤是对悬浮液中细胞（脾或胸腺的单细胞悬浮液或者培养物）进行短期标记的方法。

注意事项：

实验室应具备进行放射性化合物操作的各种相关设备。

1.放射性工作专用的水浴槽，保温箱和离心机；

2.在进行标记操作的时候，用盖革氏计数器监测操作区域；

3.做好35S固体与液体废物的处理工作；

4.在实验开始之前，要得到相关部门的批准；操作中，要严格地遵照国家管理条例的要求。

试剂与设备

●在培养基中的细胞

●冰冷却的PBS（参见附录A）

●标记培养基:

不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI1640培养基，水浴预热到37℃

●[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸（800-l200Ci/mmol=2.93-4.44×1013Bq/mmol）

●15或50ml锥形聚丙烯离心管

●对标记培养基充分透析的胎牛血清（FCS）

●L-谷氨酸.

●微量吸管

●恒温箱

●离心机（冷冻）

操作步骤

（一）细胞的准备工作

1.在室温下,以300×g离心5分钟，收集到107-108个细胞；

2.在锥形离心管中，用10ml37℃的标记培养基洗涤细胞，然后300×g离心5分钟；

3.丢弃上层清液；

4.细胞沈淀加入标记培养基，重复洗涤一次。

（二）前脉冲Prepulse

1.洗涤后的细胞,用37℃预热的标记培养基重新悬浮（4ml含20×106个细胞），在37℃孵育30分钟，间歇漩涡振荡，以耗尽细胞内原有的蛋氨酸和半胱氨酸；

2.室温解冻[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸；

3.注意:

[35S]蛋氨酸容易挥发，请在专用的、装有活性炭过滤器的通风橱内，打开[35S]蛋氨酸储存液。

目前，不易挥发的[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸均有商品出售。

4.细胞液在室温下,以300×g离心5分钟，弃上清。

（三）脉冲Pulse

1.将细胞团重新悬浮于标记培养基中（浓度20×106个细胞/1ml）；

2.加入250µCi的[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸（9.25×109Bq）；

3.细胞放入37℃恒温箱中，孵育30分钟到3小时，孵育期间经常振荡，以保持细胞悬浮；

4.细胞液在室温下,以300×g离心5分钟，弃上清；

5.警告:

使用过的培养基和洗涤液均含有放射性，因此，请按规定方法操作和处理放射性物质；

6.用10ml冰冷的PBS重新悬浮细胞，反复洗涤两次；

7.按“细胞提取液的制备”（见Protocol43）中的方法进行细胞处理和分析，或者-20℃冻存细胞。

质量要点

1.如果脉冲需要持续1小时以上，需要在无菌的条件下，向标记培养基中添加2%的胎牛血清和2%的L-谷氨酸；

2.对于大多数类型的细胞，可以采用带螺口的组织培养瓶，并在湿润的、含5%CO2的培养箱中进行孵育；

3.孵育必须在37℃进行，温度低会显著地减少掺入到蛋白质中的放射性；

4.也可以使用14C-标记的氨基酸作标记，其半衰期长，有利于在较长的时间（几个星期）内使用标记的蛋白质,例如标记杂交瘤B细胞分泌的单克隆抗体，就常采用14C-标记的氨基酸混合物（丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸）。

参考文献

1.Coligan,J.E.,Gates,F.T.,III,Kimball,E.S.andMaloy,W.L.（1983）Radiochemicalsequenceanalysisofbiosyntheticallylabeledproteins.Meth.Enzymol.91,413-434.

2.Meisenhelder,J.andHunter,T.（1988）Radioactiveproteinlabellingtechniques.Nature（London）335,120.

（李京华朱正美）

第六节免疫胶体金标记抗体及检测抗原

基本原理

胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物，可以检测单一和多重抗原。

胶体金在电解质中不稳定，但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。

一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金，可作标记二抗进行免疫检测，本方法应用范围广，染色后的样品可以长期保存。

试剂和设备

●超速离心机

●显微镜

●温箱

●分光光度计

●0.2um微孔滤膜

●载玻片，盖薄片,滤纸

●氯金酸钠

●1％柠檬酸钠水溶液

●山羊抗鼠Ig抗体

●对T淋巴细胞特异的鼠抗人单克隆抗体

●自人外周血分离的白细胞悬液

●10％氯化钠

●1％聚乙二醇

●0.01mol/LpH7.2的PBS

●1%戊二醛乙醇溶液

●50％硝酸银溶液（提前一天配制）

●明胶显影液，2g明胶溶解于99ml蒸馏水中，加1ml甲酸

操作步骤

（一）胶体金溶液制备

1．称取0.1g氯金酸钠，溶解于1L去离子水中；

2．加热煮沸，剧烈搅拌下，迅速加入25ml新配的1％柠檬酸钠溶液；

3．继续煮沸5分钟，至溶液变成桔红色；

4．用蒸馏水将溶液的525nm波长下的光密度吸收值调到0.8。

（二）胶体金的包被

1．将山羊抗鼠Ig抗体以36900g离心30分钟；

2．上清液经0.2