免疫分析标记技术.docx

免疫分析标记技术.docx

《免疫分析标记技术.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫分析标记技术.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

免疫分析标记技术

免疫分析标记技术

摘要:

较系统地综述了目前应用于免疫分析检测中的各种标记技术:

放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记和金标记方法的原理、特点及免疫检测现状,同时对免疫分析标记技术的发展进行展望。

关键词:

免疫分析,标记技术,研究进展

Abstract:

Variouslabeledtechniquethathavebeenappliedimmunoassaypresentlywasintroduced,includinglabeledradiation,labeledenzyme,labeledluminophor,labeledfluoresceinandlabeledparamagnetic-particlealongwiththeirprinciplecharacteristicandactualityofimmunoassay,andtheirprospectswerealsodiscussedinthispaper.

Keywords:

immunoassay;labeledtechnique;researchprogress

免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础,研究标记以各种标记物（定量信号）来对某种物质进行定性或定量检测的研究。

标记免疫分析[1]一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记,这种标记物既保持了抗体或抗原的活性,也不影响标记物的活性,当它与相应抗体或抗原反应后,可以直接测定复合物中的标记物,从而直接对目标物质进行定量分析。

通过标记物的信号放大作用,可以提高免疫分析技术的敏感性。

随着全世界对食品安全问题的关注程度越来越高,食品中污染物和危害物的检测日益重要,这就需要快速、准确、灵敏、能进行多组分分析的检测技术[2]。

免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点,已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。

而在这一基础上,标记物的选择、研究就相应也成了免疫分析研究的重点内容。

检测领域的免疫分析标记方法主要有放射物标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记、金标记外,还出现了超顺磁性粒子标记。

1放射物标记分析

用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）是美国科学家Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法[3]。

该技术利用核素标记物的放大效应,改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。

1.1标记物种类

一般来说,RIA中标记抗原或抗体所用的放射性核素,最常用的是125Ñ、121Ñ、3H,3H能放射出B射线,而125Ñ、121Ñ能放射出C射线,然后用C计数仪和液体闪烁计数仪测定。

3H半衰期长,标记时需在特殊装置中进行,故多由放射性化学试剂中心做成药盒供应。

其次B射线的检测需要昂贵的液体闪烁记数器测定,不易普及,故近来采用化学方法将被检测物和酪氨酸甲酯生成带有苯酚基的衍生物,便可用121Ñ或125Ñ标记。

125Ñ半衰期为60d,121Ñ半衰期为8d,现今多趋向使用125Ñ。

1.2标记方法

放射物标记中最常用的是外标记。

碘标记的方法很多,最常用氯胺T法,氯胺T是一种氧化剂,它能使125Ñ液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘,然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢如图1。

目前,应用到食品安全此外,氯胺T还可用于纯化乳过氧化酶（Lactoperoxidase）作催化剂以碘化蛋白质,这是一种最温和的碘化法,其原理是将酶与过氧化氢形成络

合物,然后使碘氧化。

1.3应用现状

放射性标记法利用同位素标记的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性相结合,精确敏感性好（ng、pg）,样品用量少,易规范化,是其他任何生物测定法所无法比拟的[4]。

而且最近有人研究放射性标记在两相溶液中的检测,克服了溶剂互不相溶影响抗原抗体特异性反应的灵敏度[5]。

然而,其在应用上的缺点也是显而易见的,如需特殊设备,虽涉及放射性微小,但仍会面临公众反核的负面影响。

此外,放射免疫分析较难进行自动化分析,试剂盒的有效期短的缺点使其面临新一代更灵敏、稳定、快速而且自动化程度高的测量技术的挑战[6]。

2荧光标记分析

以荧光标记的荧光免疫分析（fluoresceinimmunoassay,FIA）是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。

荧光标记免疫法灵敏度高,但荧光素常会产生生物学毒性,导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降[7]。

2.1标记物（荧光素）

荧光素是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。

目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：

异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等，然而,实际应用最广的只有异硫氰酸荧光素[8]。

这种标记免疫分析法主要是利用了免疫学反应的特异性和荧光素易被发现的敏感性的优点。

但由于高本底影响和监测仪器的灵敏度低,荧光标记的技术一直受到限制。

2.2酶作用后产生荧光的物质

某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。

例如，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。

其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。

5．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）等的螯合物可发射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测定。

2.3荧光素标记

荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型,即:

酰基氯,由磺酸制备;异硫氰酸和重氮盐类,这两种通常由相应的胺制备,通过化学键作用于相应的抗原、抗体反应结合。

目前标记方法主要是透析法和直接标记法两种。

以FITC标记为例:

FITC含有异硫氰基,在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合,形成荧光抗体结合物,如图2。

直接法该法以0．5mol／LpH9．5碳酸盐缓冲液稀释IgG质量分数至2％，取相当于抗体蛋白量1／loO～1／150的FITC溶于相当于IgG溶液量1／10的pH9．5碳酸盐缓冲液中。

将FITC溶液在磁力搅拌下，缓慢加入抗体溶液。

不同温度条件下，反应时间有所不同，一般为2～4。

C，6h；7～9℃，4h}20～25℃，l～2h。

透析法有袋内标记和袋外标记两种。

袋内标记是将抗体蛋白以0．025mol／LpH9．0的碳酸盐缓冲液调整其蛋白质量分数至1％，装透析袋内。

称取蛋白量1／20的FITC溶于10倍抗体溶液量的0．025mL／L碳酸盐缓冲液中，将装好的透析袋浸没于FITC溶液中，置4'C16～18h，其问定期以磁力搅拌器搅拌，每次l～2h。

将透析袋取出，置0．01mol／LpH7．1的PBS中透析4h，留待过滤。

2.4应用现状

免疫荧光抗体技术的应用

（一）细菌学诊断利用免疫荧光抗体技术可直接检出或鉴定新分离的细菌，具有较高的敏感性和特异性。

链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、宋内氏痢疾杆菌、李氏杆菌、巴氏杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌、马鼻疽杆菌、猪丹毒杆菌和钩端螺旋体等均可采用免疫荧光抗体染色进行检测和鉴定。

动物的粪便、黏膜拭子涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣等均可作为检测样本，经直接法检出目的茵，具有很高的诊断价值。

对含菌量少的标本，可采用滤膜集菌法，然后直接在滤膜上进行免疫荧光染色，这一方法已在水的卫生细菌学调查、海水细菌动力学研究中得到应用。

（-二）病毒病诊断用免疫荧光抗体技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段。

如猪瘟、鸡新城疫等可取感染组织做成冰冻切片或触片，用直接或间接免疫荧光染色可检出病毒抗原，一般可在2h内做出诊断报告。

猪流行性腹泻在临床上与猪传染性胃肠炎十分相似，将患病小猪小肠冰冻切片用猪流行性腹泻病毒的特异性荧光抗体作直接免疫荧光检查，即可对猪流行性腹泻进行确诊

3酶标记分析

免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。

1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（enzyme-labelledantibodytechnique），用于生物组织中抗原的定位和鉴定。

1971年，Engvall，VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。

20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。

目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。

3.1标记物

用于标记的酶用于标记的酶应具有如下一些特点：

①高度的特异活性和敏感性；②在室温下稳定；③易于获得并能商品化生产；④与底物反应的产物易于显现。

到目前为止,酶标记法所用的酶大多是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。

每种酶通过与自己的特殊作用底物反应,而产生典型的有色沉淀物。

通过反应的颜色与被检测物的相关关系,从而对被检物进行定量分析。

（一）辣根过氧化物酶过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）。

HRP是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖18％），分子质量约为40ku。

HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，使产生一定颜色的产物。

二）碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP），系从小牛肠黏膜和大肠杆菌中提取。

AKP的底物种类很多，常用对硝基苯磷酸盐，酶解产物呈黄色，可溶性，最大吸收波长400nm

（三）葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶系从曲霉中提取，对底物葡糖糖的作用长借过氧化物及其显色底物来加以显示。

如果显色底物为邻苯二胺，则反应后呈棕色，阴性者为黄色，极易用目视法判断，其灵敏度高于过氧化物标记抗体。

3.2标记方法

目前标记的技术一般是通过交联剂将酶与抗体或抗原相结合。

交联方法主要有:

戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法、二硝基苯酚法（FNPS）、二异氰酸甲苯法（TDI）。

一般都是利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反应。

3.3应用现状

酶标记因其催化底物可与核素一样起到信息放大作用,而减少放射性废物,曾被认为可以完全取代RIA。

目前,在我国酶标免疫检测由于其检测灵敏度高、方法简单、所用仪器相对便宜,因此发展空间也很大。

开发商品试剂盒也有很好得实用价值。

但是,这种依靠比色法的检测所受的干扰因素太多,其灵敏度和稳定性未能高于RIA,而且底物一旦显色后就难于复原,因此是一次性的。

另外,酶结合反应时

间很难确定,酶随着时间的延长很容易失活,影响测定效果,结果也不容易保存。

有研究者[8]认为,把几种结构相关或非相关的农药抗体结合,利用这种混合技术进行几种农药的多残留分析,对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品,可以节省大量的时间和工作量。

4发光标记分析

20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。

狭义的发光免疫分析（luminescenceimmunoassay,LIA）主要是指化学发光免疫分析（chemilumi