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生物大分子标记与相互作用研究方法
生物大分子的标记及其相互作用的研究方法
摘要
生命科学在今年取得了巨大的发展和进步。
同时这些发展给化学家提出众多的问题，有待于在理论、实践及相应的研究方法上进行更深入的研究。
好的研究方法能极大地推动科学的进步。
随着科学发展，化学和生命科学逐步交叉融合，一些从事化学科学研究的领域的人开始接触生命科学研究。
本文将为从事生命科学化学交叉领域的人员介绍一些重要和基础性的研究方法。
本文将分两部分，首先介绍生物大分子的标记方法，然后在介绍其相互作用的方法，着重介绍其中运用到的物理和化学方法。
生物大分子的标记方法主要介绍蛋白质和核酸的标记与识别方法，大分子间相互作用主要介绍荧光能量共振转移技术和双分子荧光互补技术。
关键词：
生物大分子标记反应检测荧光染料核酸探针生物素-亲和素系统
生物分子固定化荧光能量共振转移技术双分子荧光互补技术
生物学在20世纪取得了巨大进展。
以基因重组技术为代表的一批新成果，标志着生命科学研究进入了一个崭新的时代。
人们不但可以从分子水平了解生命现象的本质，而且从更新的高度去揭示生命的奥秘。
生命科学研究从宏观向微观发展，从最简单的体系去了解基本规律，向最复杂的体系去探索相互关系。
人类基因组计划完成后，人们的注意力转向后基因组计划，从序列基因转移到结构基因和功能基因[1]，这一发展给生物学家和化学家带来巨大的机遇挑战：
一方面，获得的巨大基因组序列信息将给给研究者带来无尽的研究课题和方向，因为所得序列中，绝大多数基因的功能和机制都不清楚，是一个巨大的有待科学家开发的领域；然而另一方面，面对巨大的序列信息，如何把这些信息都解析出来，转换成人们能理解的结构与功能信息能呢？
就传统的生物学方法来说，已经不能很好的去解决这些问题了，因为生命科学已经朝着两各方面发展，一是研究生命科学中的生物大分子结构和功能，生命科学超分子体系的反应机制等，二是面对巨大的信息量需要发展大规模高通量技术来更快的解决问题。
这些显然需要在化学家的参与，生物学方法和化学方法的结合才能有质的突破[2]。
生命科学的发展给化学家提出众多的问题，有待于在理论、实践及相应的技术上进行更深入的研究。
尤其是在研究方法上，化学方法更是极大的推动了生命科学的发展，另一方面，生命科学的发展的发展反过来也为化学研究提供了一些方法。
两者互相促进，互相发展[3]。
本文将主要综述生命科学研究中涉及到的重要的化学方法，讨论其基本原理，应用和最新进展，并介绍一些生物学方法在化学研究中的应用。
由于生命科学和化学学科交叉越来越明显，越来越多的化学工作者把工作重点转移到生命科学领域，因此本文的主要目的就是为从事生命科学化学交叉领域的人员介绍一些重要的研究方法。
而要从事这一领域首先必须学会跟生物大分子打交道，要了解如何去识别和区分它们，然后要了解它们间的相互作用关系。
因此，本文将分两部分，首先介绍生物大分子的标记方法，然后在介绍其相互作用的方法，着重介绍其中运用到的物理和化学方法。
一、生物分子的标记
生物大分子标记是生命科学研究中一类极其重要的方法。
在研究中生物大分子无法直观看见，所以就需要引入一些标记分子和生物大分子相互作用，这些分子与生物分子发生的作用是特异性的，而且又能显示出某些易于被观察或检测的特征[4-6]。
这样就能特异性的指示被标记的生物分子。
或者使用物理方法，即放射性标记来指示生物大分子。
放射性标记是较早出现的一种分子示踪方法，灵敏度高，但是由于放射性存在一定的危险性，因此现在使用的不多，更多的使用化学方法。
目前最广泛使用的生物分子标记或示踪物是各种有机染料。
对于蛋白质，有多种成熟的染色方法，可以对处在电泳凝胶中的蛋白质染色[7]。
这类染色是非特异性的，即只要是蛋白质就能染色，并不识别其序列，主要用于检测蛋白质，和电泳配合使用。
目前的方法主要有考马斯亮兰染色、银染、荧光染色、负染等。
马斯亮兰染色目前广泛运用的是考马斯亮兰R-250[8]。
其原理是利用考马斯亮兰分子上的芳香苯环，与蛋白质的疏水区结合；同时其亚硫酸基团与蛋白质的正电荷结合，可使蛋白质染出兰色条带。
该法简单、快速，是蛋白质电泳检测和定量分析常用的一种方法。
但是该方法灵敏度相对不高。
银染是迄今为止灵敏度最高的一种染色法。
其基本原理是银离子与蛋白质分子上的酸基（COO-）结合，然后银离子被还原为自由的银，可使蛋白质条带呈现深棕至黑色。
荧光染色较为方便，荧光染料有Fluoresceinisothiocyanate，dansylchloride，rho-damineisothiocyanate等[9]。
这些荧光染色方法需要在电泳之前荧光染料与一定的功能基团相结合。
共价结合的荧光标签在蛋白质检测方面非常敏感，超过了考马斯亮兰。
由于荧光染料属于自已发光，因此成像效果好，而且还可以通过不同的染料实现多色荧光。
因此在细胞成像方面优于其他方法[5,10]。
负染的原理主要是有选择的将金属离子沉淀在胶上，蛋白质条带不能被染色，因此，它们所处的位置是透明的。
这种方法非常简单快速。
但这种方法受到物理化学因素影响大，不推荐为一般性方法。
这几种非特异性蛋白质染色方法很常用，也有大量资料描述具体方法，这里不再赘叙。
近年来，由于生物技术高速发展，很多商业化的蛋白质染色产品上市[11]，例如Invitrogen旗下MolecularProbes公司持有专利的SYPRO®荧光蛋白染料系列。
这些荧光染料不仅灵敏度高，而且使用和操作起来更方便快捷，节省大量时间。
显示核酸主要使用溴化乙锭（EB），EB本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。
因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。
它也属于非特异新，即只要是核酸就能染上色，不识别序列。
尽管这种染色方法使用了多年，但是它是一种潜在致癌物，使用起来危险性很大。
因此近年出现了一些新型安全无毒的替代品。
首先是SYBR系列染料，属于Invitrogen旗下MolecularProbes专利产品。
灵敏度高而且毒性低。
分四种不同的种类，值得提出的是SYBRGreenI和SYBRGreenII这两种。
第一种SYBRGreenI具有双链DNA的专一选择性，这一特性可以用来专一识别双链DNA，用在在荧光定量PCR中[12]。
SYBRGreenII与SYBRGreenI则刚好相反，它是检测RNA或单链DNA的高灵敏染料。
此外还有一些商业化的新型染料[13]，比如GelRed&GelGreen，无毒花菁染料-UltraPower等，这些和上类似，使用安全方便。
这类染料也常用在基因芯片中检测DNA[11]。
上述两类染料都是分别针对蛋白质和核酸的非特异性染料，在实际研究中，经常需要做到对生物分子的特异性识别[14-17]。
因此发展出了一些特异性标记方法。
其中对蛋白质的特异性标记用得最多最成熟的方法就是免疫学方法，即利用针对某一特定蛋白制备抗体，然后对特异性抗体进行标记，利用标记来指示分子，利用抗体的特异性来识别蛋白。
这一技术最早的应用是westernblot，即利用抗体在蛋白质样品中识别特定蛋白。
根据对抗体标记方法的不同，可以将免疫识别技术分为放射免疫，酶联免疫，荧光免疫，化学发光免疫等，基本原理都是利用抗体识别特定蛋白质，只是标记物不同而已。
特异性抗体制备采用生物学方法，即采用目标蛋白刺激动物，动物产生免疫反应而产生大量特异性抗体，分离提取这些抗体即可。
由于几种免疫检测方法在分子识别上的原理基本相同，就只以酶联免疫为例介绍具体方法。
酶联免疫简称ELISA，是目前应用的最广发展最成熟的蛋白质标记和检测方法[14,16]。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
下图介绍三种ELISA的基本原理：
第一种是间接法，首先将待测样品吸附于固相表面，使用蛋白特异性抗体（第一抗体）识别样品中的靶蛋白，然后使用酶标记的第二抗体识别第一抗体。
洗去未结合抗体，二抗上标记的酶在加入底物后催化底物显色，从而可以指示靶蛋白的存在及含量。
第二种是双抗夹心法，与第一种方法不同的是使用固定化第一抗体来捕获靶蛋白，用第二抗体指示靶蛋白。
第三种竞争法则是使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。
Fig1.ELISA的基本原理
尽管免疫检测特异性高，灵敏度也高，而且商业化程度高，但是对于大规模检测来说，免疫法依然显得太昂贵。
人们尝试使用化学小分子物质来识别特异性氨基酸序列，从而降低成本，易于大规模检测。
一个比较成功的例子是基于基于FLAsH（FluoresceinArsenicalHairpin）技术的Lumio™系统[18-20]。
它使用一种有机小分子联胂的荧光素衍生物作为染料，该小分子能够识别四半胱氨酸序列，由“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys””组成，其中的Xaa指非半胱氨酸的氨基酸。
Lumio™试剂处于非结合状态时基本上无荧光性。
然而，通过与四半胱氨酸序列结合，Lumio™试剂变得具有高度的荧光性。
当Lumio™试剂与四半胱氨酸标记的肽或蛋白质结合，在505nm处有吸收峰，并且，在528nm处有最大的绿色荧光发射。
因此该染料可以检测含有上述特异性序列的蛋白质。
但是多数蛋白质不含上述序列，因此通常为了示踪或标记某些蛋白，可以通过蛋白融合技术在靶蛋白上加入这一序列，这样就可以供Lumio™试剂识别了。
Fig2.Lumio™试剂结构及作用机制[18]（处于非结合状态时基本上无荧光性。
然而，通过与四半胱氨酸序列结合，Lumio™试剂变得具有高度的荧光性。
）
核酸的特异性识别就简单多了，就是依据碱基互补配对原则，设计寡核苷酸探针来寻找特异序列。
但是寡聚核苷酸本身是难以本检测的，因此需要在寡聚核苷酸上标记从而使之被观察到。
棱酸探针在现代分子生物学、生物医学等领域是一个极其重要的工具，有着广泛的应用。
基础研究中，核酸探针被用于重组基因库筛选、DNA作图、原位杂交、DNA测序等分析；临床诊断中，核酸探针被用于各种病原体（细菌、病毒）鉴定、癌症和遗传病诊断、DNA指纹分析等。
另外，在药物筛选、食品分析中核酸探针也得到r大量运用。
寡聚核苷酸探针的标记方法有很多，最初使用放射性同位素标记，即通过在合成探针过程中加入带放射性的核苷酸；但是放射标记有危险性，因此又出现了很多非放射性标记，例如用酶[21]、荧光素、生物素、地高辛等标记[11,13,22]。
这些标记方法都很成熟，使用的也比较多，有很多都已经开发成为商品化试剂盒。
下面简要介绍一些常用的非放射标记系统：
①.基于碱性磷酸酶的标记系统，通过化学方法将碱性磷酸酶结合到探针末端，碱性磷酸酶催化底物水解即可指示探针的存在和位置；②.基于辣根过氧化物酶（HRP）显示系统，与碱性磷酸酶类似的系统；③ABC显示系统。
此系统的核酸探针以生物素（biotin）为标记物，让生物素结合到探针上，在亲和素上结合酶，然后利用亲和素（avidin）对生物素的强的结合性形成亲和素、生物素以及酶三者形成的复合物（complex，C）在该酶的显色反应下以完成对核酸探针的检测。
这几种是基于酶标记的方法。
还有一些基于发光标记的方法，比如荧光素标记和化学发光标记[13,22,23]，发光标记因其高灵敏度而逐渐受到欢迎。
生物发光主要有两类，一类是源自于萤火虫体内的荧光素，它在荧光素酶和ATP共同作用下可发出荧光，灵敏度很高。
另一类来自于水母体内的绿色荧光蛋白GFP。
生物发光标记灵敏度高，但是对条件要求温和，价格也昂贵，所以目前应用的不多，主要还是采用化学发光。
目前主要应用到鲁米诺体系和吖啶类化合物体系。
增强鲁米诺发光体系，该体系主要利用HRP可催化鲁米诺发光的原理，在探针上结合HRP从而催化鲁米诺发光。
吖啶类化合物在H2O2催化下会发光，因此可以这类化合物连接到探针上，经H2O2催化探针便发光。
不论是在蛋白还是核酸标记标记中，生物素-亲和素系统都经常被用到。
而且在生物分子固定化中也是经常用到。
因此在这里做一简要介绍。
在生物标记中，这一系统常用作放大系统以提高检测灵敏度。
生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin-System，BAS）是70年代末发展起来的一种生物反应放大系统。
随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。
近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、SPA等。
生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。
BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术[24,25]。
生物素是一种小分子物质，属水溶性维生素B族成员。
亲和素是一种糖蛋白，。
分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合（Fig3a）。
这是其放大作用的基础，因为它能结合四个生物素分子，就意味着一个亲和素结合生物素后信号将放大四倍。
事实上，由于生物素还分子较小，可以通过交联从而结合更多亲和素使信号放大更多（Fig3b）。
ab
Fig3.a.生物素-亲和素结合模型b.生物素-亲和素系统信号放大机制
生物素上含有多个活性基团，能通过各种方式共价结合到生物大分子上，包括蛋白质和核酸，这一特点使得这一系统能用于标记和检测各种生物大分子。
其在标记中的具体的应用在前面已经提到，主要是将其中之一连接到抗体或核酸探针上，另一个连接上标记物如酶，荧光素等，利用生物素和亲和素之间强的结合来实现信号指示和放大作用。
生物素－亲合素系统不仅在分子标记方面有广泛的应用，在生物分子的固定方面也有很广的应用[26-28]。
固定的方式主要有有两种：
一是将生物素用化学方法固定在固相材料表面，将靶分子也结合到生物素上亲和素作为中间配体介导靶分子固定；二是将亲和素固定在固相材料表面，将靶分子结合到生物素上（Fig4）。
该系统的主要优点是结合力强，而且能防止固相表面干扰，通用性好，能用于任何生物素化分子的固定。
Fig4生物素－亲合素系统固定分子
这套固定化系统常用于生物传感器中分子的固定才，以及研究分子相互作用和基因芯片，蛋白质芯片等中。
二、生物大分子相互作用
生物大分子相互作用主要包括蛋白质间相互作用，核酸间相互作用，蛋白质核酸间相互作用等，这些相互作用很复杂，使用的方法很多是纯粹的生物学方法，比如酵母双杂交系统，相对较为麻烦。
人们把物理化学方法引入到生物分子相互作用的研究中。
在这里主要介绍两种：
荧光共振能量转移和双分子荧光互补技术。
荧光共振能量转移（FRET）（Fluorescenceresonanceenergytransfer）是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用以及其它一些方面的研究中得到广泛应用[29-32]。
FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。
当FRET发生时，供体的荧光减弱而受体的荧光增强。
荧光素在激发态的寿命是10-9秒，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。
如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。
从FRET可以了解到分子间的距离信息，从而了解分子间的分布和动态[33,34]。
在用FRET技术研究分子间相互作用时，需要对分子进行荧光标记，在两分子上分别标记供体荧光分子和受体荧光分子在多数情况下，供体与受体染料是不同的，FRET的可以通过对供体的荧光淬灭和受体的敏化荧光的产生来检测。
由于具体情况不同，使用的标记方法和测量手段不尽相同，所以结合具体例子来说明。
首先是研究蛋白质的折叠，蛋白质折叠是一个非常繁杂的过程，因为它涉及到大量的途径来将无数去折叠构象连接成为唯一的天然构象。
FRET已经能够测量自由状态的单分子蛋白折叠的表面自由能特征，这些数据在分子集合是难以得到的。
例如BenjaminSchuler[35]等将一个绿色供体染料和一个红色受体染料连接在冷休克蛋白（CspTm）的氨基和羧基端的半胱氨酸残基上。
选择该蛋白是因为它的高度稳定性，能够承受结构方面的干扰以及它的在分子集合实验中的热力学和动力学行为的简单性。
如果一个折叠好的CspTm被激光照射，被激发的供体染料将能量快速传递给受体染料，因为它们的间隔仅仅1纳米，大部分光子由受体发出。
当加入化学变性剂后蛋白去折叠，导致供体和受体的平均距离变大，能量转移变小，被受体发射的光子减少。
为了使结果量化，由两种不同长度的标记相同染料的多聚脯氨酸螺旋作为控制系统，在供体和受体之间构成了固定的间隔，使染料之间的距离不因变性而变化，其他的参数和实验组的参数一样变化。
通过相关参数的比较处理，得到去折叠的多肽重新形成构象的时间限度和折叠自由能障的高度限制，结果与简单的统计模型一致（Fig5）。
Fig5示意图：
用荧光供体（Alexa488）和荧光受体（Alexa594）标记的蛋白和多聚脯氨酸螺旋[35]（a：
折叠的CspTm，含66个氨基酸残基b：
去折叠的CspTmc：
（Pro）6;d：
（Pro）20蓝色的激发光激发绿色供体染料，后者把能量转移给红色的受体染料。
在每种模式中，FRET的效率E和距离R的函数关系用兰色的曲线表示，供体和受体染料的距离的分配概率P用红色曲线表示。
）
在自组装的纳米生物传感器的开发中，也可以用到FRET技术探索纳米分子期间之间的相互作用。
IgorlMeclintz[36]等人用自组装的纳米生物传感器实现了以QD为供体的FRET。
多拷贝的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MBP）以C末端的寡聚组氨酸片段与QD结合。
在MBP上有糖结合位点，，传感器在可控制的溶液里自组装而成。
传感器结构如图：
一个530-nmQD被大约10个MBP环绕。
（只画出了一个）每一个MBP在唯一的cysteine95位点结合Cy3，在糖结合位点特异结合的CD-Cy3.5，构成完整的纳米传感器。
激发QD后由第一步FRET作用MBP-Cy3被激发，它的发射光再由第二步FRET激发CD-Cy3.5，加入麦芽糖后竞争性替换了®-CD-Cy3.5，阻断了第二步FRET，引起Cy3的发射增强。
有两种构型：
一种是在体系中加入β-cydodextrin-QSY9（一种淬灭剂）结合到MBP的糖结合位点，引起了FRET，QD的光亮度减低，而加入麦芽糖后（麦芽糖与MBP的亲和力大于β-cydodextrin-QSY9与MBP的亲和力）竞争性地替换下β-cydodextrin-QSY9后，QD的光亮度又增加了。
另一种麦芽糖传感器构型是由QD和Cy3标记的MBP以及β-cydodextrin-Cy3.5组成。
这时QD发挥传感器作用是通过两步FRET来完成的，从而克服了QD供体和受体距离的固有限制。
在复合体中每个530纳米QD供体和10个Cy3标记的MBP分子结合，Cy3的作用是一个桥梁性受/供体，能最大程度地将能量传递给可被麦芽糖替换的结合在MBP糖结合位点的β-cydodextrin-Cy3.5。
用Cy3染料标记的MBP滴定QD时引起QD荧光的减弱以及相应Cy3发射光的增加进而引起β-cydodextrin-Cy3.5发射的增加，表明在三者之间发生了两步FRET。
当再加入麦芽糖时，则只有Cy3的发射增加，第二步FRET被阻断（Fig6）。
Fig6：
530QD-MBP-Cy3-®-CD-Cy3.5传感器的功能和性质示意[36]：
a表示了530QD-MBP-Cy3-®-CD-Cy3.5maltose传感器的结构。
b530QD-MBP-Cy3-®-CDCy3.5的光谱特性，530QD的吸收光谱用品红表示，发射光谱用兰色表示。
MBP-Cy3的吸收光谱绿色表示，发射光谱黄色表示。
®-CD-Cy3.5的吸收光谱橙色，发射光谱红色。
c.530QDs在MBPD95C-Cy3/未标记的MBP比率逐渐增大时的光谱特征。
双分子分子荧光互补（bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC）分析技术，是由Hu[37]等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术．该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用．其后发展出的多色荧光互补技术（multicolorBiFC），不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较。
该方法利用绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）及其突变体（YFP，CFP）的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接．如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光[38]。
在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性[39]（Fig7）。
Chang-DengHu[37]等人利用BiFC技术研究bZIP蛋白家族中Fos和Jun两个成员蛋白质间的相互作用功能。
他们将YFP蛋白从氨基端第155位氨基酸β桶状区酶环结构处切开成YN（1～154氨撼酸）和YC（155～238氨基酸）两部分，鞭分别与Fos和Jun的bZIP结构域片段（bFos，bJun）连接成bFosYC耱bJunYN，并进行体内、体外检测．结果发现，只有当bFosYC和bJunYN同时存在时才能检测到荧光。
这一结果显示了bFos，bJun两片段相互作用（Fig7）。
Fig7.BiFC原理及应用。
带有YFP（或其突变体GFP,CFP）的两片段相互接近后发出荧光，指示与其结合的两分子相互作用[37]。
（C中红色线代表完整的YFP荧光发射谱，蓝色和绿色代表bFosYC和bJunYN同时存在时的发射谱，第四条线代表bJunYN和无bFos片段的YC共存时的光谱，由于两者不发生相互作用，第四条线几乎不可见）
相对于FRET技术，BiFC技术因为不发生互补就没有荧光，产生的背景干扰小的多。
而且GFP有众多突变体，各自发出不同波长的荧光，因此发展了多色BiFC技术，能同时观察多个分子间相互作用。
这一技术特别适用于生物体内相互作用的实时观察。
也可实现体外相互作用研究。
除以上两种外，还有表面等离子体共振（surfaceplasmonresonance，SPR），原子作用力显微技术（atomicforcemicroscopy，AFM），微量热技术（microcalorimetry）等物理化学方法研究生物大分子相互作用。
三、结论与展望
随着生命科学和化学研究的深入，两者结合也会越来越紧密，在此基础上产生的新方法也
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