罗布麻黄酮的提取及抗氧化活性的研究详解.docx
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罗布麻黄酮的提取及抗氧化活性的研究详解
罗布麻黄酮的提取及抗氧化活性的研究
摘要：
本课题以罗布麻为原料，采用乙醇浸提法提取罗布麻中的黄酮，考察了乙醇溶剂浓度、提取时间、提取温度、料液比、提取次数等因素对罗布麻黄酮提取率的影响，其中选择了乙醇溶剂浓度、提取温度、提取时间、料液比四个因素设计正交实验来优化黄酮的最佳提取工艺，并对羟基自由基的清除和对超氧阴离子清除等两个方面进行黄酮抗氧化性的研究。
得到的实验数据表明，影响罗布麻总黄酮提取的主要因素为乙醇溶剂浓度、液料比，其次提取时间、提取温度。
罗布麻中黄酮的最佳提取工艺为乙醇溶剂浓度为65%，提取时间4h，温度80℃，料液比1:
15，测得罗布麻总黄酮的含量为2.89%。
除此之外，罗布麻黄酮对羟基自由基和超氧阴离子具有清除作用，且清除率与黄酮存在一定的量效关系。
关键词：
罗布麻，黄酮，乙醇浸提法，抗氧化活性
StudyExtractionandAntioxidantActivityof
FlavonoidsfromApocynumVenetumL.
13293432YEYixuan
（DepartmentofLifeScience,QiuZhenSchoolof
HuzhouUniversity,Huzhou313000,）
Abstract：
TheextractionofflavonoidsinApocynumvenetumL.byethanolextractionwasstudiedinthispaper.Theeffectsofethanolconcentration,extractiontime,extractiontemperature,ratioofmaterialtoliquidandextractiontimesontheextractionrateofApocynumvenetumL.wereinvestigated.Theorthogonaldesignwasusedtooptimizetheextractionprocessofflavonoids,andtheremovalofhydroxylradicalandtheremovalofsuperoxideanionwerestudied.TheflavonoidsStudyonOxidationResistance.TheexperimentaldatashowedthatthemainfactorsaffectingtheextractionoftotalflavonoidsofApocynumvenetumwereethanolsolventconcentration,liquidtomaterialratio,extractiontimeandextractiontemperature.Theoptimumextractionconditionswere:
ethanolconcentration65%,extractiontime4h,temperature80℃,ratioofsolidtoliquid1:
15,totalflavonoidscontentofApocynumvenetumwas2.89%.Inaddition,flavonoidsofApocynumvenetumhaveascavengingeffectonhydroxylradicalandsuperoxideanion,andtheclearanceratehasadose-effectrelationshipwithflavonoids.
Keywords:
ApocynumvenetumL,totalflavonoids,extraction,optimization,antioxidantactivity
目录
1引言1
1.1罗布麻的简介1
1.2罗布麻的研究前景1
1.3罗布麻的价值1
1.4罗布麻的化学成分1
1.5黄酮类化合物简介1
1.6罗布麻中黄酮类化合物的结构类型2
1.7罗布麻中黄酮的提取方法2
1.8罗布麻中黄酮的分析方法2
1.9本文研究内容2
2实验内容2
2.1实验材料、试剂及仪器2
2.1.1实验材料
2.1.2实验试剂
2.1.3实验仪器
2.1.4实验附属仪器
2.2实验流程3
2.2.1基本实验流程
2.2.2紫外分光光度法实验流程
2.2.3实验流程图
2.3实验方法4
2.3.1标准芦丁溶液的配制
2.3.2标准曲线制备
2.3.3计算公式推算
2.3.4单因素考察
2.3.5正交试验设计
2.3.6样品的制备
2.3.7抗氧化活性的研究
2.3.8计算方法
3结果与讨论8
3.1单因素结果8
3.2正交结果11
3.3抗氧化活性研究结果12
3.4讨论14
4.总结和展望14
4.1实验总结14
4.2展望14
参考文献15
致谢16
1.引言
1.1罗布麻的简介
罗布麻不仅可以称之为红麻，还可以叫做叫泽漆麻、野茶和吉吉麻或茶叶花。
罗布麻（ApocynumvenetumL.）实质上即为夹竹桃植物对应的叶或全草[1]。
罗布麻主要集中在河南、西北、华北以及东北等不同区域。
甘、微苦，凉，入肝经，清热平肝，利水消肿[2]。
罗布麻浑身是宝，秆可作为造纸原料，其对应的叶部位可以直接作为饲料与饮料的原料，而对应的根茎部位乳胶液则可以直接用于橡胶制作。
就中医学的角度而言，其主要以地上部分作为入药材料，而罗布麻本身具备的药性微寒，味苦甘，功能为清热解火，息风平肝，主治头眩目晕、失眠等症状；叶的部分含有罗布麻苷，具有强心作用，可制成茶、药片、烟等形式，为治疗高血压的良药[3]。
1.2罗布麻的研究前景
罗布麻是集药用、纺织业、食用与植被恢复及旅游观赏于一身的优良植物，是世界上稀少的优良的野生植物资源，罗布麻应用的综合开发对人类有着非常积极的意义。
对罗布麻的开发利用开展实施阶段，可对其产业结构更好、更快的加以优化，获得更理想经济收益，还使综合开发、利用罗布麻有了更为可靠的根基，使其具备医用、绿化、食用、橡胶、饲草等诸多用途。
罗布麻全身都有利用价值，皆能够作为药材食用，因为其各部分的生理活性存在差异，因此当前一般是通过现代中药提取分离技术来针对罗布麻药用价格展开研究，从而区分开各部分的各种有效成分，对症下药。
未来将会对其有效成分更深入的展开分析。
因此分离法、提取法、草渣使用、高新技术等在未来将会有非常大利用空间。
1.3罗布麻的价值
罗布麻有着非常好的耐盐性能，因此在0.5%-1.0%含盐量的土壤中依旧能够生长，此外还能够在3米至4米的地下水位中生长，在盐层厚度为十厘米至二十厘米的地表荒地也能够生长。
并且，其根系非常粗壮，且深，能够在强盐化的表土重盐层一米至两米之中，将地下含敖分少的水分吸取，能够成片地于敖土之中获得茁壮成长[5]。
1.4罗布麻的化学成分
本实验采用的是罗布麻的叶，罗布麻叶中主要含含羟基的黄酮衍生物，单宁，酸类，脂肪酸醇，醇类，糖类，烷类有机物，氨基酸类，无机盐与其它化学成分等。
1.5黄酮类化合物简介
黄酮类化合物大部分属于结晶体固体，但黄酮苷类比较特殊，属于无定形粉末。
黄酮类化合物分子内有没有交叉共轭体系、取代位置、数目、助色团类别等诸多因素都能够对它的颜色发挥决定性的作用。
灰黄至黄色：
黄酮、黄酮醇及其苷类；
黄至橙黄色：
查耳酮；
不显色：
二氢黄酮
显微黄色：
异黄酮（二氢黄酮、异黄酮类）。
黄酮类化合物在经过羟基糖普化之后，能够更好地溶解于水中，但是相反而言，在有机溶剂内的溶解度却会越来越小。
一般而言，在诸如甲醇、乙醇等的强极性溶液中，黄酮往往更容易溶解，但是在诸如氯仿、笨等的有机溶剂之中，却难以溶解，甚至于完全不溶解。
黄酮类化合物在水中的溶解度与其糖链呈正比，前者越大，意味着后者越长。
1.6罗布麻中黄酮类化合物的结构类型
在罗布麻内最为根本的有效成分即为黄酮类化合物，而这里提出的该种化合物普遍是指有两个苯环，采用三碳链连接形成的系列化合物。
根据三碳链对应的取代、成环以及氧化的特征，有可以将其中的黄酮类化合物分为黄酮、黄酮醇、双氢黄酮（醇）等各种不同种类。
当前自然界中存在最多的产物主要是黄酮醇与黄酮。
1.7罗布麻中黄酮的提取方法
目前，罗布麻总黄酮的提取方法包括：
水提法、醇提取法、有机溶剂提取法、超声波提取法、溶剂回流提取法、微波提取法以及浸泡提取。
本实验采用乙醇浸提法。
称取适量的罗布麻粉，控制实验条件：
加入适量浓度的乙醇溶剂，根据规定的乙醇料液比，严格把控温度，同时注意回流提取的时间以及次数，最后采用抽滤以及冷却等多种方式，得到最终需要的罗布麻黄酮提取液。
1.8罗布麻中黄酮的分析方法
黄酮类化合物分析的方法很多。
如今运用频率较高的方法有液相色谱一串联质谱法、气相色谱法一质谱联用法、旋光定量法、高效液相色谱法、分光光度法、薄层色谱法等，不同方法适用于不同的情况，需要从提取物的性质、工艺设备、提取费用消耗等诸多因素着眼来明确最佳的方案。
本课题研究最终选用的方法是分光光度法，分光光度法在实验室应用中较为实用，有效，得出的结果可信度也相对较高。
其中有铜离子络合法，系数倍率法，比色法，导数光谱法，多波长吸收度比值差法，旋光定量法等[6]。
在不同的测量中采用最佳的方法以取得更优的结果。
此次实验采用的是在紫外光分光光度法。
1.9本文研究内容
罗布麻具有延缓衰老、降血压、降血脂、软化血管、解酒护肝、排毒养颜、安神助眠、解烟毒等功效，特别是罗布麻黄酮能使血小板内的环磷酸腺苷水平升高，并对血小板活化反应具有较强的抑制和抗血栓形成的作用。
本文采用乙醇浸提法对罗布麻中的黄酮的提取进行研究。
考察罗布麻黄酮提取的乙醇溶剂浓度、提取时间、提取温度、料液比、提取次数等单因素的影响。
在此基础上通过正交设计优化了黄酮提取的工艺条件。
同时还研究了罗布麻黄酮对•OH清除作用和对超氧阴离子清除活性的测定。
2.实验内容
2.1实验材料、试剂及仪器
2.1.1实验材料
药店买的罗布麻。
2.1.2实验试剂
主要化学药品和试剂见下表2-1。
表2-1主要的化学药品和试剂
名称
纯度
生产厂家
芦丁标准品
中国药品生物制品检定所
NaNO2
分析纯
上海振欣试剂厂
Al（NO3）3
分析纯
上海振欣试剂厂
NaOH
分析纯
湖州湖试化学试剂有限公司
乙醇
分析纯
湖州湖试化学试剂有限公司
石油醚
分析纯
杭州巨化公司
蒸馏水
湖州师范学院生产
2.1.3实验仪器
主要仪器与设备见下表2-2。
表2-2主要仪器与设备
仪器名称
型号
厂家
真空干燥箱
ZK
北京科伟永鑫试验仪器厂
电热恒温水浴锅
DK-98
天津市泰斯特仪器有限公司
循环水式真空泵
SHZ-D（III）
巩义市英峪予华仪器厂
电子精密天平
PB203N
梅特勒托利多仪器有限公司
离心泵
0301149D
常州国华电器有限公司
紫外-可见分光光度计
UV-3100
上海谱达仪器有限公司
2.1.4实验附属仪器
烧杯，1mL移液管，2mL移液管，量筒，25mL容量瓶，50mL容量瓶，圆底烧瓶，冷凝管，布氏漏斗，抽滤瓶，玻璃棒，锥形瓶，称量纸，药匙，铁架台，洗耳球，抽滤纸。
2.2实验流程
2.2.1基本实验流程
罗布麻粉→加乙醇→水浴回流浸提→离心→抽滤→亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定→计算黄酮含量。
2.2.2紫外分光光度法实验流程
罗布麻粉→加乙醇水浴回流浸提→抽滤→收集滤液→lmL样液→加入1.0mL的5%亚硝酸钠→加入1.0mL的10%的AL2（NO3）3→加入5mL的4%NaOH→测量510nm吸光度→计算黄酮含量。
2.2.3实验流程图
具体流程图见图2-1。
罗布麻粉3g
加入乙醇，回流浸提后抽滤
药渣取滤液1mL
亚硝酸钠-硝酸铝比色法
配液
分光光度法
测紫外吸收510nm处吸光度
图2-1提取罗布麻黄酮过程
2.3实验方法
2.3.1标准芦丁溶液的配制
根据相关文献记载，精密量取对照品溶液4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL，，将其置于依此编号1-5的5个25mL容量瓶中，加入1mL的10％NaNO2溶液。
5min后加入1mL的10％AL（NO3）3溶液，摇匀6min后加入lmol／L的NaOH溶液5mL，用60％乙醇稀释定容，摇匀，制成含芦丁3.2～11.2μg／mL的系列标准溶液备用。
2.3.2标准曲线制备
将5组制备好的标准芦丁溶液，按分光光度法，在510nm处测定吸光度。
以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，做回归分析，得标准曲线。
测定结果见下表2-3与图2-2。
表2-3芦丁的吸光度
芦丁浓度C（μg/mL）
33.716
42.133
50.550
58.967
67.384
吸光度（A）
0.043
0.105
0.160
0.197
0.256
图2-2芦丁标准曲线
以对照品溶液浓C和吸光度A进行线性回归，得到回归方程为A=0.0127C+0.0098其中R2=0.9996，可知线性关系满足。
线性的范围为8.46～67.38μg/mL。
2.3.3计算公式推算
Mn=C*V式中：
Mn：
溶液中黄酮类化合物的总质量，g
C：
溶液中黄酮类化合物的浓度，（g/L）
V：
溶液中总体积，L；
黄酮提取率（％）=
×100％式中：
Mn：
溶液中黄酮类化合物的总质量，g
M为原料的质量，g
2.3.4单因素考察
（1）乙醇溶剂浓度对黄酮提取率的影响
准确称取3g罗布麻叶粉，置于干燥的150mL圆底烧瓶中，分别加入35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液。
控制溶剂料液比在1：
15，提取时间为3h，提取温度为80℃，经过提取回流2次，提取清液之后，用移液管移取1mL滤液，然后在容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，静置5min后，加入1mL的10％AL（NO3）3溶液，摇匀，再静置6min，加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，定容。
在室温下放置30min，完全冷却后，在510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。
确定最佳提取溶剂及浓度。
（2）提取时间对黄酮提取率的影响
准确称取3g罗布麻粉，在经过干燥处理后的圆底烧瓶内（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度为65%）加入其中，对料液比加以控制，为1:
15，轻轻震荡使其混合均匀，然后在水浴锅内放置圆底烧瓶，对温度进行控制，为80℃，五个烧瓶的回流时间分别控制在1h，2h，3h，4h，5h。
经过提取回流两次，提取获取提取液之后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，静置5min后，加入10％AL（NO3）3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，定容。
在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。
确定最佳提取时间。
（3）提取温度对黄酮提取率的影响
称取罗布麻叶粉3g，在经过干燥处理后的圆底烧瓶（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度控制在65%）加入其中，对料液比加以控制，为1:
15，轻轻震荡使其混合均匀，，将圆底烧瓶置于水浴锅中，分别以
的温度展开试验，以每次
的频率实施两次回流操作，由此得到提取液，然后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，5min，后加入10％AL（NO3）3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，定容。
在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。
最终明确最佳提取温度。
（4）料液比对黄酮提取率的影响
准确称取3g罗布麻粉，在经过干燥处理后的圆底烧瓶（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度控制在65%）加入其中，对其料液比进行控制，分别为
，轻轻震荡使其混合均匀，然后在水浴锅内放置圆底烧瓶，使温度控制在80℃，等待3h回流时间，并回流两次，取获取提取液之后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，5min，后加入10％AL（NO3）3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，定容。
在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。
最后对最佳的料液比加以明确。
（5）提取次数对黄酮提取率的影响
准确称取3g的罗布麻粉，在经过干燥处理后的圆底烧瓶内（150ml）内放置，再将乙醇溶液（浓度为65%）加入其中，对料液比加以控制，为1:
15，震荡摇匀，将圆底烧瓶置于水浴锅中，使温度控制在80℃，等待180min的回流时间，第一次回流完成后，滤渣重复操作三次，取获取提取液之后，用移液管移取1mL滤液，然后容量瓶中加入10％NaNO2溶液1mL，5min，后加入10％AL（NO3）3溶液1mL，摇匀，6min后加人5mL的lmol／L的NaOH溶液，在室温下放置30min冷却后，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。
确定最佳提取次数。
2.3.5正交试验设计
取乙醇溶剂的浓度、提取温度及时间、料液比作为考察因素，每个因素选择三个水平进行实验，最终选择的参考指标是实验所成功提取的黄铜含量，下表2-4为详细的实验设计方案中各要素的取值。
表2-4因素水平表
因素
A
B
C
D
水平
乙醇溶剂浓度
温度（℃）
时间（h）
料液比
1
55%
60
2
1：
10
2
65%
70
3
1：
15
3
75%
80
4
1：
20
2.3.6样品的制备
称量罗布麻粉一共3g，在经过干燥处理的圆底烧杯（150ml）内放置，再取乙醇（浓度为65%）45ml添至其中。
对溶液的料液比加以控制，为1:
15，提取时间、温度、回流提取次数分别为3h、80℃、2次，提取清液之后，通过移液管来移取滤液，滤液的容量为1ml,实施此操作之后，将浓度值10%的
溶液放入容量瓶内，取量1ml，保持静置，时间控制在5min，结束后把浓度10%的
溶液添至内部，容量为1ML，轻轻摇晃，使其混合均匀，静置，保持6min，然后将
的
溶液添至其中，容量为5ml，待其冷却，于510nm处测吸光度，设置空白对照（以1.0mL水按同样方法进行操作）。
确定最佳提取溶剂及浓度。
其余8个实验按正交实验设计表2-5依次进行。
表2-5正交实验安排
实验号
因素
A乙醇溶剂
B温度（℃）
C时间（h）
D料液比
1
1（55%）
1（60）
1
（2）
1（1:
10）
2
1（55%）
2（70）
2（3）
2（1:
15）
3
1（55%）
3（80）
3（4）
3（1:
20）
4
2（65%）
1（60）
2（3）
3（1:
20）
5
2（65%）
2（70）
3（4）
1（1:
10）
6
2（65%）
3（80）
1
（2）
2（1:
15）
7
3（75%）
1（60）
3（4）
2（1:
15）
8
3（75%）
2（70）
1
（2）
3（1:
20）
9
3（75%）
3（80）
2（3）
1（1:
10）
2.3.7抗氧化活性的研究
精确称取罗布麻粉3g，200mL石油醚提取40min，去除石油醚，再把去脂后的罗布麻粉放置到30mL蒸馏水中，浸泡时间为24h，随后通过减压浓缩，实施热过滤，得到浓缩状态下的罗布麻总黄酮液体，然后稀释至料液比大致为1:
15。
样品的测定:
准确吸取1.0mL的罗布麻的黄酮提取液于烧杯中，并加入1mL蒸馏水、4mL4%NaOH溶液，并将其作为对照组进行吸光度值的测定。
结合回归方程对样品中黄酮总含量实施计算。
（1）罗布麻黄酮对·OH的清除作用
对Fenton反应法进行参考，从而将·OH自由基产生体系模型构建起来[7]。
在混合H2O2、Fe2+两种溶剂之后，能够形成·OH，其Fenton反应式子是：
，由于·OH的反应活性非常强，加之反应快速，因此于536nm处，产物的吸收非常强烈，此时若将能够对·OH进行有效清除的被测物添至其中，那么能够和邻二氮菲产生竞争，从而结合·OH。
然后通过固定反应时间法，对于反应液体的吸光度，在
处进行测量，与空白液进行对比，那么就可以很好地测量·OH受到的被测物的清除作用效果。
分别将浓度为0.75mmol·L-1的邻二氮菲溶液、
的PBS缓冲液放入五个烧杯内，取量分别为1ml、3.5ml,对其进行摇晃，使混合均匀，结束后将浓度为0.75mmol·L-1的FeSO4溶液加入其中，选量为1.5ml，，及时使溶液混合均匀。
再将不同量的黄酮溶液分别添至五个烧杯之中，混合均匀后，放在温度为37℃的水中进行反应，60min后对吸光度A536（加药）进行测量，在536nm波长中开展。
与上述方法相同，提取液用
替换，据此来对
（损伤）加以测定。
与上述方法相同，
、提取物都不增加，对
（未损伤）加以测定。
计算·OH清除率。
·OH清除率=A2-A1/A0-A1
上面的式子中:
A0对应H2O2溶液未添加时的吸光度；
A1：
对应H2O2溶液添加之后的吸光度；
A2：
加黄酮溶液时的吸光度。
（2）黄酮对O2的清除作用
此过程运用了邻苯三酚自氧化法[14]。
在碱性环境下（
）邻苯三酚会出现自氧化，通过此反应O2-·、有色中间产物得以产生，其中有色中间产物的相对吸收峰存在于
之中。
将O2-·清除剂添至反应中这一过程，使得O2-·的生成遭受抑制，邻苯三酚据而出现自氧化逆反应，在420nm处，溶液的吸收峰会越来越小，因此只需要对A420相对值进行测量就能够对自氧化反应的程度作出判断，且能够将O2-清除剂的清除率计量出来。
选取
缓冲溶液（浓度0.05mol·L-1）及蒸馏水各5ml，分别添至五个经过干燥处理的烧杯内，
轻轻摇晃使其均匀混合，于水浴锅（25℃）内放置烧杯，进行加热，持续20min，再将烧杯取出。
在五个烧杯中，分别将浓度为
的黄酮溶液添至其中，然后取0.3ml的邻苯三酚（3mmol·L-1）分别添至烧杯内，再次放入25℃的水浴锅中加热30s，加热期间补加蒸馏水至25mL。
再放置于温度为25℃的水中反应4min，最后再将HCl（浓度8mol·L-1）滴入两滴，据此来迫使终止反应过程。
吸光度的测定选择在420nm处进行，样品选取的参比物是浓度相同的试样提取物，模型组则使用蒸馏水对试液进行代替。
通过下面的式子对清除率进行计算。
式中：
A空白=溶液的吸光度
A样品=黄酮溶液的吸光度
2.3.8计算方法
（1）测定吸光度方法
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