聚酰胺树脂纯化.docx
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聚酰胺树脂纯化
第一章前言
1.1甘草简介
甘草（Licorice）是豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（PapiliantaeTaub）甘草属植物，是一种应用极广的中药，素有“十方九草”之称[1]。
深秋，荚果裂开，籽粒随风散步大地上，天然繁殖。
茎挺拔直立，根如圆柱，直径三四厘米，大的五六厘米，长一米多，最长者达三四米。
甘草多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带，在引黄灌区的田野和河滩地里也易于繁殖。
它适应性强，抗逆性强，不愧是植物界抗干旱的能手，斗风沙的先锋。
甘草在中草药中具有“众药之王”的美誉，是重要市用中药,来源于豆科（leguminosae）植物甘草、欧甘草、胀果甘草的干燥根和茎。
国产甘草主要有：
乌拉尔甘草（GlycyrrhizauralensisFisch）、胀果甘草（G.inflataBatal）、光果甘草（Glucyrrhizicacid）、黄甘草（G.eurycarpaP.C.Li）、粗毛甘草（GlycyrrhizaasperaPall.）、云南甘草（GlycyrrhizayunnanensisChengf.etL.K.Ti）、园果甘草（G.squamulosaFranch）、刺果甘草（G.pallidifloraMaxim）、欧甘草（GlycyrrhizaglabraL.）和欧甘草变种（G.glabravar.glandalifera）等。
其中以乌拉尔甘草（GlycyrrhizauralensisFisch）分布最广、产量最大[2]。
甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。
用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹，四肢疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性[3]。
1.2主要有效成分及药理作用
国内外学者对甘草的化学成分和药理作用进行了许多研究，主要有效成分是黄酮类化合物和三萜皂苷。
据现有资料报道，甘草的化学组成极为复杂，已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物以及香豆素类、18种氨基酸、多种生物碱、雌性激素和多种有机酸等[4]。
其中，黄酮类成分具有明显的抗溃疡、解痉、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素样作用[5]。
近年来还发现甘草黄酮对艾滋病毒（HIV）有很强的抑制增殖作用，对甘草黄酮的研究应用已经引起人们的重视[6]。
1.2.1甘草黄酮的化学成分
近年来的研究表明，甘草中存在着一种重要的生理活性物质，即黄酮类化合物。
黄酮类化合物的基本母核早期是指2-苯基色原酮,近年来泛指两个苯基通过三碳链相连形成的化合物,即具有C6-C3-C6基本骨架,包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、查尔酮及它们的二氢衍生物和黄烷醇、花青素等。
甘草黄酮（Glycyrrhizaflavonoids,FG）是从甘草提取物中得到的一类生物活性较强的成分,许多学者对其化学成分进行了大量的研究工作。
邢国秀等人[7]在文章中给出甘草黄酮类150多个化合物的结构和名称,它们分别属于黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢查尔酮类等十几大类。
甘草黄酮类的中药化学成分主要有甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙等。
1.2.2甘草黄酮的药理作用
（1）抗肿瘤作用[8]：
日本德岛文理大学佐藤利夫教授领导的研究小组,近几年开发出一种能有效抑制癌细胞扩散的新药，研究小组发现,天然甘草中含有查尔酮衍生物,它对上述两种酶都有抑制作用。
（2）抗氧化作用[8]：
甘草黄酮类物质可以防止低密度脂蛋白（LDL）发生脂质过氧化反应,降低病人血浆中的低密度脂蛋白被氧化的易感系数,提高血浆中的低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝聚、抗滞留的能力,可以用来治疗各种由于血脂高、脂质氧化所引起的疾病。
（3）黄酮类化合物抗糖尿病（DM）的作用研究：
给糖尿病大鼠每日腹腔注射，能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖及胰岛素水平，同时能显著地降低糖尿病大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、脂质过氧化物含量，而对正常大鼠血糖无影响。
（4）抗HIV病毒作用[8]：
日本学者从甘草鞣质活性成分研究中所得到的酚性成分（包括黄酮类成分）加强了人体免疫缺陷病毒（HIV）对ATL-IK（来源于成人T细胞性白血病患者的细胞株）的拮抗作用。
其中两种新甘草查尔酮低浓度时显示出对HIV增殖的抑制作用。
（5）抗心律失常作用：
实验证实了甘草总黄酮具有抗心律失常作用,又证明:
对乌头碱诱发的心律失常甘草甜素无对抗作用,而甘草类黄酮与异甘草素有明显拮抗作用,并在此基础上发明了一种含有异甘草素的抗心律失常药物。
（6）抗衰老作用[9]：
黄酮类化合物是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂,能与超氧阴离子反应,阻止自由基反应发生。
与铁离子络合阻止羟基自由基生成,与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。
（7）抗炎和抗变态反应作用[9]：
前苏联学者研究表明，glycycoumarin有较强的消炎和抗变态作用，比磺胺和抗生素的药效要好。
1.3甘草黄酮提取和分离纯化方法的研究进展
1.3.1甘草黄酮提取方法的研究进展
现有的甘草黄酮提取方法很多，其基本原理都为通过物理、化学方法破坏甘草的细胞壁，再通过甘草黄酮的极性及溶解性以达到其分离提取的目的。
水提法和溶剂提取法是目前较成熟的工艺技术，新发展起来的有超声波提取、微波提取、超滤提取、加压热水提取和超临界萃取等方法[10]。
1.3.2甘草黄酮分离纯化方法的研究进展
经上述方法提取后的甘草黄酮还不能达到使用标准，需要经过分离、纯化、检验合格后才能投入使用。
对于甘草黄酮分离纯化相关的研究报道很多，归纳起来主要有如下几种典型的方法：
经典醋酸乙酯萃取法、重结晶法，树脂法，超滤法和双水相体系法等[11-13]。
萃取法[14]需使用大量的有机溶剂，在实际生产中受到一定限制。
树脂法[12]即柱色谱分离技术，是目前发展较快的一种分离方法，一般使用硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、离子交换吸附树脂以及大孔树脂等固态物质作为吸附剂，用适当的溶剂洗脱分离混合物，该技术的应用已经广泛深入到分离纯化、合成化学、生物医学工程等各个领域。
近年来国内外发展的黄酮分离纯化的处理新技术采用树脂吸附，这一方法在医药领域和天然产物纯化中广为运用，在提取精制有效成分方面尤为有效。
离子交换树脂根据被洗脱物的酸碱性进行洗脱，但离子交换树脂法处理量小，提取率低。
由于甘草中总黄酮含有大量的脂溶性成分，其提取物的水分散液中有大量难以分散的沉淀，也限制了大孔吸附树脂在甘草黄酮纯化上的应用[15]。
聚酰胺吸附树脂是新发展起来的一类有机分子聚合物吸附剂。
聚酰胺树脂是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，它对黄酮类化合物有较强的吸附性能，主要通过氢键和范德华力吸附[16]。
聚酰胺树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简单、解析条件温和，使用周期长、节省费用等优点，现已广泛用于黄酮类物质的提取。
聚酰胺树脂法是近几年发展起来的一种分离纯化黄酮类物质较好的树脂分离方法。
聚酰胺吸附树脂精制黄酮粗提物不仅具有方法简单、成本低、效率高、稳定性高和容易再生等特点，而且得到的产品安全，不存在重金属、有机溶剂毒性残留等问题[17]。
据报道及文献记载，聚酰胺树脂已用于分离纯化多种植物黄酮，杨武英,上官新晨等[18]通过不同条件下聚酰胺树脂对青钱柳黄酮的静态和动态吸附与解吸特性的研究,确定聚酰胺树脂对青钱柳黄酮的最佳精制工艺；采用优选出的最佳精制工艺对青钱柳黄酮粗提物进行多次精制,得到高纯度青钱柳黄酮。
王成章等[19]在利用超滤纯化银杏叶黄酮甙的研究中发现聚酰胺树脂对黄酮的选择性好，其吸附量为18～20meJg树脂，经过超滤膜去杂纯化后，聚酰胺树脂吸附，得到纯度为45．3％黄酮。
张伟，葛志强等[20]研究聚酰胺树脂分离纯化复方山楂提取物的工艺及参数的结果是聚酰胺树脂对总黄酮为优惠吸附，采用50%和70%乙醇溶液梯度洗脱效果最佳。
纯化后总黄酮保留率高达93.0%，纯化物质量仅为纯化前的8.12%。
说明采用聚酰胺树脂分离纯化黄酮类化合物效果是很好的。
1.4本研究的主要内容和意义
国内外对甘草酸的研究已经很深入，现已形成规模化生产，而对甘草黄酮的研究主要集中在化学成分和药理作用上，对其分离纯化研究较少。
而甘草黄酮类化合物具有多种生物活性，可广泛用于医药、保健、食品添加剂及化妆品等领域[21]。
因此，对甘草黄酮分离纯化方面的研究是一项值得重视的课题。
目前，利用聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮的研究只有张睿，林强等[22]利用大孔吸附树脂提取甘草中黄酮类化合物，得到甘草黄酮的含量为53.5%，再通过聚酰胺柱色谱分离后，黄酮的含量可以达到90.26%；郑颖，蓝闽波等[23]利用聚酰胺树脂分离甘草总黄酮并且研究其抗氧化活性，得出的结论是甘草粗黄酮经过聚酰胺树脂精制后，纯度提高，抗氧化活性明显增加。
由于聚酰胺树脂对黄酮有较好的吸附性，而使用该树脂分离纯化甘草黄酮的相关研究很少，且没有具体的工艺参数，因此，本课题选取聚酰胺树脂为分离纯化甘草黄酮的吸附树脂，研究利用该树脂分离纯化甘草黄酮的实验参数，包括pH值、料液浓度、洗脱液组成、洗脱流速、柱径高比等，以确定该树脂分离纯化甘草黄酮的最佳条件。
研究结果对提高甘草有效成分利用率，聚酰胺树脂柱层析在分离纯化黄酮类化合物上的应用具有重要意义。
第二章实验材料与方法
2.1实验材料、试剂与仪器
2.1.1材料
甘草，产于宁夏。
2.1.2试剂
本研究所用试剂见表2.1。
表2.1实验所用试剂一览表
试剂名称
纯度
生产厂家
亚硝酸钠
AR
北京化学试剂公司
硝酸铝
AR
北京化学试剂公司
氢氧化钠
AR
北京化学试剂公司
芦丁
标准品
Sigma公司
95%乙醇
AR
北京化工厂
盐酸
AR
北京化工厂
聚酰胺吸附树脂
上海摩速科学器材有限公司
2.1.3仪器
本研究所用仪器见表2.2。
表2.2实验所用仪器一览表
仪器名称
型号
生产厂家
电子分析天平
HR-200
A＆D公司
高速万能粉碎机
FW-100
天津市泰斯特仪器有限公司
旋转蒸发器
RE-52AA
上海亚荣生化仪器厂
紫外可见分光光度计
UV754N
上海精密科学仪器有限公司
数控自动部分收集器
SBS-100
上海青浦沪西仪器厂
恒流泵
HL-1
上海青浦沪西仪器厂
核酸蛋白检测仪
DU800
Beckman公司
2.2实验方法
2.2.1甘草的预处理
将11月份挖取的甘草，洗净，切薄后室温干燥备用。
实验前，取干燥的甘草磨碎成干粉状使用。
2.2.2聚酰胺树脂的预处理
聚酰胺树脂用95％乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无酒精味，再用2％NaOH浸泡24h，滤掉上层碱液，以蒸馏水洗至中性后用2％柠檬酸酸浸泡24h，再用蒸馏水洗至中性并浸泡备用[14]。
2.2.3甘草黄酮的制备
采用最佳超声前处理条件（超声功率100W，超声时间1h）对甘草原料进行前处理，之后，在最佳提取条件下（固液比1：
14，乙醇体积分数75%，回流时间2h）进行提取实验，提取3次，合并滤液，抽虑并浓缩至一定体积，得实验样品液。
2.2.4甘草总黄酮的分析方法
2.2.4.1标准曲线的绘制
精确称取在105℃干燥恒重的芦丁对照品10mg,用95%乙醇溶解，摇匀，定容至10ml，使之成为浓度为1mg/ml的芦丁标准品溶液，作为贮液备用。
图2.1芦丁标准曲线
精密量取上述溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml,分别加水至3ml，加5%亚硝酸钠水溶液0.5ml，混匀后放置6min，加10%硝酸铝水溶液0.5ml，混匀后放置6min，加入5%氢氧化钠溶液2.5ml，混匀，放置15min后，蒸馏水定容至10ml。
用紫外分光光度计，在500nm下测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标[24]。
绘制标准曲线如图2.1所示，计算出回归方程。
2.2.4.2甘草总黄酮的测定
精密吸取待测总黄酮样品液0.2ml于l0mL容量瓶中，按照标准曲线制定方法操作，测定吸光值，由回归方程求出总黄酮浓度。
2.2.5聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮的静态吸附与解吸实验
2.2.5.1pH值对聚酰胺树脂吸附效果的影响
黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，因此要找出吸附的最佳条件，有必要考察pH对吸附性能的影响。
本实验研究了聚酰胺树脂分别在pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的样品液中的吸附情况。
室温下分别称取聚酰胺干树脂0.2g置9个100ml三角瓶中，加水浸泡树脂4h，使其吸水饱和，滤掉多余水，分别加入不同pH值（用HCL或NaOH溶液调节溶液的pH值）、浓度为4.67mg/ml样品液40ml，25℃、70次/min振荡12h，再保温静置12h，使其充分平衡。
测定平衡液中总黄酮的质量浓度，并计算相应吸附量（Q）[20]。
2.2.5.2样液浓度对聚酰胺树脂吸附效果的影响
分别研究了样液浓度在1.25、1.75、2.43、3.08、3.51、3.90、4.43mg/ml下聚酰胺树脂的吸附情况。
室温下分别称取聚酰胺干树脂0.2g置7个100ml三角瓶中，加水浸泡树脂4h，使其吸水饱和，滤掉多余水。
将不同浓度的样液pH调为10.0，分别加入以上7个三角瓶中。
25℃、70次/min振荡12h，再保温静置12h，使其充分平衡。
测定平衡液中总黄酮的质量浓度，并计算相应吸附量（Q）。
2.2.5.3洗脱剂对聚酰胺树脂解吸效果的影响
常用的洗脱剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、酸、碱以及它们的混合液，都有较强的洗脱能力，但甲醇具有毒性，丙酮等洗脱能力过强，易洗脱下大量杂质。
考虑到实际工作中的其他问题，采用乙醇-水为洗脱剂。
室温下分别称取聚酰胺干树脂0.2g置6个100ml三角瓶中，加水浸泡树脂4h，使其吸水饱和，滤掉多余水。
将样液浓度为3.51mg/ml、pH值为10.0的样品液各40ml分别加入以上6个三角瓶中。
25℃、70次/min振荡12h，再保温静置12h，使其吸附饱和，测定平衡液中总黄酮的质量浓度，并计算吸附量（Q）。
然后，滤出液体，分别加入浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液30ml进行解吸，25℃、70次/min振荡12h，再保温静置12h，取洗脱后溶液并分别测定其黄酮含量，并计算相应解吸率（%）。
2.2.6聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮的柱层析实验
2.2.6.1柱高对层析效果的影响
根据聚酰胺树脂的吸附量和上样量设计一系列柱高（10cm、13cm、16cm、19cm），取经过预处理的聚酰胺树脂装柱。
按设计量（黄酮浓度3.51mg/ml，pH值为10.0，6ml）上样，上样流速0.5ml/min,用已选定的洗脱剂（70%乙醇）动态洗脱，洗脱流速0.5ml/min,采用数控自动部分收集器分布收集洗脱液，测定黄酮浓度，绘制洗脱曲线；收集洗脱纯化液，浓缩至一定体积，测定浓度，计算回收量、回收率；放入烘箱干燥后称重，得干粉量，计算纯度；根据回收率、纯度的大小以及洗脱曲线的分析情况，确定聚酰胺层析柱分离纯化甘草黄酮的最佳柱高。
2.2.6.2洗脱流速对层析效果的影响
取经过预处理的聚酰胺树脂装柱，使柱高为16cm，按设计量（黄酮浓度3.51mg/ml，pH值为10.0，6ml）上样，上样流速0.5ml/min,用已选定的洗脱剂（70%乙醇）动态洗脱。
为选取较优的乙醇洗脱流速，分别以0.5、0.75、1.00、1.25ml/min流速过柱，并收集洗脱液，测定黄酮浓度[18]。
绘制洗脱曲线；收集洗脱纯化液，浓缩至一定体积，测定浓度，计算回收量、回收率；放入烘箱干燥后称重，得干粉量，计算纯度；根据回收率、纯度的大小以及洗脱曲线的分析情况，确定聚酰胺层析柱分离纯化甘草黄酮的最佳洗脱流速。
2.2.6.3聚酰胺树脂法精制级数对甘草黄酮纯度影响试验
采用以上实验选出的最佳实验参数上聚酰胺层析柱，并收集乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积，再次采用选出的聚酰胺柱的最佳条件分离纯化该浓缩液。
测定粗品、一次过柱所得物、二次过柱所得物中甘草黄酮含量，并计算回收率、纯度。
第三章结果与讨论
3.1聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮的静态吸附与解吸的实验结果
3.1.1pH值对聚酰胺树脂静态吸附效果的影响
按照2.2.5.1描述的方法对不同pH值的样品溶液进行实验，计算吸附量（Q）。
吸附量的计算公式：
吸附量（Q）=（Co-Cv）×V/W（公式3-1）
式中：
Q—吸附量（mg/g干树脂）；Co－初始浓度（mg/ml）；Cv－余下浓度（mg/ml）；V－溶液体积（ml）；W－树脂质量（g）。
实验结果如图3.1所示。
图3.1pH值对聚酰胺树脂吸附甘草黄酮的影响
由图3.1可以看出：
pH值对吸附量影响较大，随着pH值的增加，吸附量也在逐渐增加，在pH值为10.0时达到最大，因此选择pH10.0作为甘草黄酮吸附的最佳条件。
3.1.2样液浓度对聚酰胺树脂静态吸附效果的影响
按照2.2.5.2描述的方法对不同浓度的样品溶液进行实验，计算吸附量（Q），计算使用公式3-1。
实验结果如图3.2所示。
图3.2样液浓度对聚酰胺树脂吸附甘草黄酮的影响
由图3.2可以看出:
甘草黄酮粗提物溶液的浓度是影响聚酰胺树脂吸附性能的重要因素之一。
吸附树脂的吸附容量一般以适中浓度进行较为有利，如果原液浓度偏高，则泄漏点早、处理量小、树脂使用周期短，从而树脂再生次数增多；如果原液浓度偏低，工作效率降低。
因此，选择浓度为3.51mg/ml的甘草黄酮溶液作为吸附料液。
3.1.3洗脱剂对聚酰胺树脂静态解吸效果的影响
按照2.2.5.3描述的方法对不同浓度的洗脱剂进行实验，计算解吸率（%）。
实验结果如图3.3所示。
图3.3乙醇洗脱浓度对甘草黄酮解吸率的影响
解吸率的计算公式:
解吸率（%）＝（C×V/M）×100%（公式3-2）
式中：
C－解吸液黄酮浓度（mg/ml）；V－解吸液体积（ml）；M－解吸前黄酮含量（mg）。
解吸是衡量聚酰胺树脂分离天然产物的又一重要技术参数。
考虑到甘草黄酮作为保健食品原料的安全性，选择乙醇水溶液为洗脱剂。
由图3.3可以看出:
70%乙醇的洗脱能力最强，因此选择浓度为70%的乙醇溶液作为洗脱剂。
40%乙醇的洗脱能力最差，洗脱液稍有浑浊，可能是因为用40%乙醇溶液进行洗脱时，甘草黄酮中所含杂质也被洗脱下来；其他乙醇浓度洗脱时洗脱液均澄清透明。
3.2聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮柱层析的实验结果
3.2.1柱高对层析效果的影响
按照2.2.6.1描述的方法在不同柱高下进行实验，绘制洗脱曲线，计算回收率（%）、纯度（%）。
实验结果表3.1所示。
表3.1不同柱高对聚酰胺层析柱分离纯化甘草黄酮回收率和纯度的影响
柱高/cm
10
13
16
19
纯度/%
14.34
16.67
21.16
20.16
回收率/%
61.49
72.17
78.58
76.69
由上表可以看出：
聚酰胺层析柱的柱高为16cm时，对甘草黄酮分离纯化效果最好，所得产品的纯度和回收率最大，因此初步确定16cm为最佳柱高。
实验结果表明，柱高为16cm时，上样时可观察到吸附过程的稳定性好，甘草黄酮粗提物在聚酰胺树脂上呈现明显的梯度变化，同时吸附与洗脱的时间也较适宜；柱高小于10cm时，洗脱时间太短，分离效果较差；柱高大于16cm时，虽然达到了分离的目的，但是随着柱高的增加会导致洗脱较为困难，洗脱体积明显增大，产生严重的拖尾现象，洗脱剂用量过大。
因此，选用16cm高的聚酰胺树脂柱分离纯化甘草黄酮。
3.2.2洗脱流速对层析效果的影响
按照2.2.6.2描述的方法在不同洗脱流速下进行实验，绘制洗脱曲线，计算回收率（%）、纯度（%）。
实验结果表3.2所示。
表3.2不同洗脱流速对聚酰胺层析柱分离纯化甘草黄酮回收率和纯度的影响
洗脱流速/（ml/min）
0.50
0.75
1.00
1.25
纯度/%
21.16
21.48
28.13
27.97
回收率/%
78.58
77.64
74.79
72.65
由上表可以看出：
聚酰胺层析柱的洗脱流速为1.00ml/min时，对甘草黄酮分离纯化效果较好，所得产品的纯度最大，初步确定1.00ml/min为最佳洗脱流速。
实验结果表明，洗脱流速为1.00ml/min时，洗脱曲线的对称性好，洗脱效果及分离效果均较好；洗脱流速小于1.00ml/min时，分离效果较差，粗提物中的杂质和黄酮没有很好地分离开来，导致纯度很低；洗脱流速大于1.00ml/min时，提取物回收率有所下降，纯度也略有下降，这是由于速度过快，导致乙醇洗脱液不能很好的与聚酰胺树脂上吸附的黄酮类物质进行交换，因而不能达到很好的洗脱效果。
综合考虑纯度和回收率以及洗脱曲线，选用1.00ml/min的流速为最佳洗脱流速。
3.2.3最佳条件下的洗脱曲线
用经过预处理的聚酰胺树脂装入内径为1.5cm的层析柱，使柱高为16cm，将从1g生药材中提取得到的含黄酮的浓缩提取液过柱，采用上述实验确定的最佳参数即上样浓度为3.51mg/ml，pH为10.0，上样流速0.5ml/min，用70%的乙醇以1.00ml/min的流速洗脱。
每四分钟收集1管流出液，并且使用紫外分光光度计测定吸光度，并计算甘草黄酮浓度，以洗脱体积（ml）为横坐标，甘草黄酮浓度（mg/ml）为纵坐标，绘制洗脱曲线，如图3.4所示。
图3.4聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮的洗脱曲线
由图3.4可以看出：
聚酰胺层析柱分离纯化甘草黄酮的洗脱曲线对称性较好；峰面积也较大，及回收率较高；洗脱液用量在96ml左右时，有一个微小的峰，可能是黄酮类化合物中不同组分的物质也被分离了。
因此，聚酰胺树脂分离纯化甘草黄酮具有非常好的效果。
3.2.4聚酰胺树脂法精制级数对甘草黄酮纯度的影响
采用以上实验选出的最佳条件上柱并收集乙醇洗脱液，用旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积，测定黄酮含量，干燥，称量干粉量，计算纯度和回收率。
粗品、一次过柱所得物（1级）、二次过柱所得物（2级）的黄酮含量、回收率和纯度如表3.3所示。
表3.3聚酰胺树脂法精制级数对甘草黄酮纯度的影响
精制级数
黄酮含量（mg）
回收率（%）
纯度（%）
粗品
21.06
—
6.42
1级
15.75
74.79
28.13
2级
9.95
63.17
49.75
由上表可以看出：
甘草黄酮粗提物经过聚酰胺树脂的两次吸附和解吸后，黄酮含量由粗品的6.42%升高到了49.75%，纯度提高了6.75倍。
3.3光谱鉴定
芦丁标准品和聚酰胺树脂法分离纯化后所得甘草黄酮的红外吸收光谱，如图3.5和3.6所示。
图3.5芦丁标准品红外吸收光谱（作为甘草黄酮的对照）
图3.6分离纯化所得甘草黄酮红外吸收光谱
由图3.5和3.6红外光谱鉴定图可以看出：
提取所得的甘草黄酮与对照品芦丁的特征吸收峰吻合良好，相似度较高，可以确定，纯化产物为甘草黄酮。
3.4讨论
3.4.1与已发表文献结果的比较
目前有文献报道，张睿，林强等[22]利用大孔吸附树脂提取甘草中黄酮类化合物，得到甘草黄酮的含量为53.5%，再通过聚酰胺柱色谱分离后，黄酮的含量可以达到90.26%。
本实验所得到的甘草黄酮纯化产物纯度最高为49.75%，没有达到该文献所提及的纯度，是由于只采用了一种树脂分离
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