松针原花青素的提取关键技术研究.docx
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松针原花青素的提取关键技术研究
毕业设计（论文）
课题名称松针原花青素的提取关键技术研究
学生姓名史华梅
学号0840921027
系、年级专业生物与化学工程系08级食品质量与安全
（食品科学与工程方向）
指导教师黄大川
职称副教授
2012年5月10日
松针原花青素的提取关键技术研究
史华梅
邵阳学院生物与化学工程系08级食品质量与安全（食品科学与工程方向）
湖南邵阳422000
指导老师:
黄大川
摘要
本文主要研究了微波辅助提取松针中原花青素的工艺。
通过比较3种不同处理方式的松针的吸光度，选定新鲜马尾松松针作为提取工艺研究的原材料。
微波辅助提取原花青素具有省时、高效、节能等优点,且提取物更易于分离纯化。
微波水提法的最佳条件：
功率500W，时间15min，料液比1：
9。
用可见光分光光度法对原花青素的含量进行判定，其依据是在其最大吸收波长550nm处，吸光度与原花青素的含量成正相关。
通过单因素实验和正交实验，确定微波水提法从松针中提取原花青素的最佳工艺条件：
提取温度为100℃,提取时间为150min,pH为4.0,料液比为1：
14,该条件下原花青素的吸光度为10.566。
关键词：
松针；原花青素；微波辅助水浸提法；
Studyonoptimumprocessforextractionofproanthocyanidinfrompineneedles
By：
SHIHuamei
DepartmentofBiologyandChemistryEngineering,ShaoyangUniversity,ShaoyangHunan422000,China
Directedby:
HUANGDachuan
ABSTRACT
ThispaperisastudyontheoptimumprocessforextractionofProanthocyanidinsfrompineneddles.Bycomparingtheabsorbanceofthreedifferentpineneddleswhicharedealtwiththreedifferentways,wefinallychoosethefreshpineneelesastherawmaterialstostudytheextractionprocessofProanthocyanidins.Microwave-assistedextractionofProanthocyanidinsfrompineneddlesistime-saving,efficientandenergy-saving.Theoptimumconditionsofextractionaretherateofsolutiontosolid9:
1,thepower500W,extractiontime15minutes.UsingspectrophotometrytodeterminethecontentofProanthocyanidinsfrompineneddlesintheextractsonthebasisoftheabsorbanceProportionaltothecontentofProanthocyanidinsunderthemaximumabsorptionwavelength550nm.Bysinglefactorandorthogonalexperimentthebestextractionprocessconditionswasconfirmed:
extractiontemperatureof100℃,extractingtimefor150min,pH=4.0,theratioofsolidtoliquidis1:
14.Theabsorbanceis10.566undersuchconditions.
Keywords:
pineneddles;Proanthocyanidins;Microwave-assistedextraction
目录
摘要I
ABSTRACTII
1绪论1
1.1松针的利用现状1
1.2原花青素的研究进展2
1.3本研究的目的和意义4
1.4研究的主要内容4
2材料与方法5
2.1试验材料5
2.2仪器和设备5
2.3试验方法5
3结果与分析7
3.1单因素试验结果和分析7
3.2正交试验结果与分析9
3.3验证试验结果与分析10
4结论与展望11
参考文献11
致谢12
1绪论
1.1松针的利用现状
松针是松树类植物的主要副产物之一,是一种再生速度快、一年四季均可采收、分布广泛、天然蓄积量大、可持续利用的天然再生资源。
我国有丰富的松针资源,而且品种多、分布既广又相对比较集中。
我国现有松林面积约为61006700万公顷,仅松针叶的蕴藏量就在1亿吨以上。
松针的利用在我国古代就已经开始进行了研究。
民间用松针作草药或作蒸糕点的垫料（有保鲜味美的作用）。
现在人们已对松针的化学成分、毒理、病理、药理、生理等基础研究和松针的药用、食用、饲用、生产化工原料等的应用研究都做了大量的工作,并取得丰硕的成果。
在药用方面，目前国内已试制出了松针流感晶,松针口服糖浆、护肤美容膏、护肤冻疮膏、松针跌打油等,这些主要是利用松针中生物活性物质的功效。
在食用方面，松针中含有丰富的营养素,如马尾松针中含蛋白质7%～16%、脂肪2.2%～13.1%、多缩戊糖5.2%～7.0%、钙0.45%～2.41%、磷0.03%～0.07%、叶绿素7942220mg/kg、胡萝卜素72344mg/kg、并含有18种以上的氨基酸、40余种矿物元素、多种维生素（其中维生素E较高,可达500mg/kg左右）;还含有纤维素、黄酮、激素、萜类化合物等。
这些物质都较适合于人体生长发育的需求,而松针的毒性甚微,人体食用安全可靠,因而松针是人类食用源的良好材料之一,采用适当的加工工艺,能有效地保护和强化松针的营养素,消除不良物质或因素的影响,制备出质优的天然营养保健食用品,目前主要开发的产品有:
保健运动饮料、食品添加剂、松针酒、松针果酒、松针糖果、茶等。
在饲用方面，松针对畜禽鱼等动物的生长发育有良好的功效,松针饲料或饲料添加剂对畜禽的生长发育有明显的促进作用,能提高饲料的利用率,增强畜禽鱼抗病能力,能提高肉类动物的胴体重量,提高毛皮动物的毛皮质量以及禽类的产蛋率、受精率、孵化率[1]。
在其他方面，可制备松针纤维素板、松针可降解快餐盒、松针超强吸水剂、松针人造丝、松针燃料油、松针叶精油、松香、香脂膏、药用松针浸膏、松针栲胶、糠醛、胶粘剂、脱镁叶绿素、叶绿酸钠、复合氨基酸、松针蜡、松针抗氧化剂、除臭剂、松针杀菌防腐保鲜剂和室内空气清新净化剂等产品。
1.2原花青素研究进展
1.2.1原花青素简介
原花青素（proanthocyanidin）是植物王国中广泛存在的一大类多酚物质的总称,是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成。
最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体、三聚体、四聚体等直至十聚体。
按聚合度的大
小,通常将二~四聚体称为低聚体（procyanidolicoligomers,简称OPC）,将五聚体以上的称之为高聚体（procyanidolicpolymers,简称PPC）。
儿茶素与表儿茶素的结构见图1,原花青素的结构通式如图2所示[2]。
图1儿茶素和表儿茶素的结构式
图2原花青素的结构通式
研究发现，OPC具有强大的抗氧化、清除自由基能力和对人体微循环具有特殊改善的双重功效，以高效、低毒、高生物利用而著称。
它能抑制低密度脂蛋白氧化,也是细胞循环中一些关键酶的抑制剂,它能诱导不同细胞链中脱噬作用,抑制某些癌基因的表达,因此可作为心血管疾病、癌、早老病的预防剂[3]。
近年国外关于低聚原花青素的性能研究较多,并已在饮料、药品、保健食品和化妆品业得到了广泛的应用[4-5].
1.2.2原花青素的提取和检测方法
（1）原花青素素的提取
国内外关于从松针中提取OPC.s的报道很多,一般采用水煮法[6]和溶剂提取法[7-8]。
溶剂提取法得率高,但成本高,安全性低,更可能造成环境污染。
水煮法耗能大,杂质多，操作困难。
近年来,随着微波技术的发展,微波以其促进反应的高效性和强选择性,操作简便,副产物少,产率高及产物易于提纯等优点[9],已广泛应用于生化蛋白质水解[10]及有机合成、酯化[11]等反应中,目前也有用于天然物的提取文献报道[12-14]。
经查阅资料确定本实验微波水提取的条件为:
功率为500W,时间为15min,料液比为1：
9[15]。
（2）原花青素的检测
原花青素的检测方法主要有可见分光光度法，高效液相色谱法，电化学法，流动注射化学发光法，原子吸收法，紫外分光光度法，毛细管电泳法等[16]。
原花青素最常用的测定方法是可见分光光度法，它分为香草醛－盐酸法、正丁醇－盐酸法、铁盐催化比色法、KMnO4法和pH示差法等。
香草醛－盐酸法的原理是基于原花青素A环的化学活性较高，在酸性条件下，其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合，产物在浓酸（盐酸或硫酸）作用下形成红色的正碳离子，于500nm处测定其吸光度,据标准曲线法即可得到样品中原花青素含量。
正丁醇－盐酸法测定原花青素是基于原花青素在热酸作用下能产生红色花色素，可在波长546nm处测定其吸光度[17]，以甲醇作为空白对照，据原花青素标准曲线计算样品中原花青素含量。
单体原花青素在强酸作用下，正碳离子失去质子，氧化生成花色素;聚合原花青素其单元间连接键易在酸作用下被打开，下部单元生成黄烷-3-醇，上部单元生成花色素[18]。
因此，该法与香草醛－盐酸法相比，精密度和准确度较差，且测得的原花青素含量偏低。
原理如图3所示。
1.2.3类柠檬苦素的应用前景
原花青素具有多种药理活性，如抗氧化、清除自由基、护肝解毒、抗菌及抗癌等功能。
据报道，原花青素抗氧化和清除自由基的能力远远高于VC和VE[19]，其抗氧化能力是维E的50倍、维C的20倍，是迄今为止发现的最好的天然抗氧化剂之一[20-21]。
此外它还具有防癌抗癌，防治心血管疾病，抗高血糖，抗辐射，免疫调节，改善人体微循环及保护皮肤等多种功效，是欧美国家最受欢迎的植物药之一具有抗癌活性[22-24]。
通过大鼠的急性和亚慢性毒性实验、遗传毒性实验、细菌基因突变、哺乳动物细胞染色体畸变和小鼠微核实验证明原花青素无毒[25]。
近年来PC已成为国内外研究的热点，美国、欧洲诸国、阿根廷、澳大利亚和新西兰等国相继开发了PC营养保健品或药品。
目前PC已广泛应用于食品营养添加剂、医药保健及化妆品等领域。
1.3本研究的目的和意义
我国对松针的利用研究虽起步晚,但起点相对较高,目前已取得了不少可喜的成果,这是我国松针开发利用加工生产的主流。
但是,也应清醒地看到,我国松针的开发利用潜力还很大,而且在松针开发利用加工生产方面与国外先进水平还存在着一定差距，尤其在对松针中有特殊作用成分的开发利用方面与国外相比更是落后。
因此，开展松针中原花青素的的深入研究，综合利用资源，不仅可以扩大天然药物的来源，生产出更多更好的生物活性物质和开发更有价值的功能性食品，造福人民，而且可以变废为宝，把我国松针资源优势转化成商品经济优势，产生巨大的经济效益和社会效益。
本研究旨在探索松针中原花青素的提取关键技术。
利用微波辅助提取松针中的原花青素，研究提取过程中各种因素如提取温度、提取pH值、提取料液比、提取时间对其提取效果的影响，利用正交实验对微波辅助提取松针中的原花青素的工艺进行优化，寻找最佳工艺条件，为进一步规模化提取原花青素奠定基础，实现松针的综合利用。
1.4研究的主要内容
微波辅助提取松针中的原花青素；
可见光分光光度法判定提取物中原花青素的含量；
利用单因素实验建立原花青素的提取率与提取温度、提取pH值、提取料液比、提取时间的关系，并通过正交实验和验证实验对松针中原花青素的微波辅助提取工艺进行优化。
2材料与方法
2.1试验材料
马尾松松针：
洗净晾干的马尾松松针2kg。
主要化学试剂：
盐酸（pH=2），NaOH，正丁醇，石油醚，乙酸乙酯，甲醇，硫酸铁铵，以上均为分析纯。
2.2仪器和设备
DK-98-ⅡA恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），真空抽滤机（巩义市予华仪器有限公司），7200型紫外可见分光光度计，RE-5299旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限公司），DJ-5002型pH计（福州华志科学仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱，微波炉
分液漏斗，计时器，10ml量筒，1ml移液管，25ml容量瓶，滤纸，剪刀，500ml烧杯，冷凝回流装置，普通天平
2.3试验方法
2.3.1物料预处理
取洗净晾干的马尾松松针20g，置于干燥箱50ºC干燥后待用；取取洗净晾干的马尾松松针20g，自然晾干待用。
取20g等量的同一部位松针3份，分别为新鲜（洗净沥干）、自然晾干（室温阴干）、烘箱烘干（50℃烘箱）3种不同方法处理过的松针，加入180ml的水，在功率为500W的微波炉中辅助提取时间15min，然后取出置于60℃恒温水浴锅浸提1h,真空抽滤，滤液用石油醚除酯，弃醚层再用乙酸乙酯萃取后，置于旋转蒸发仪浓缩后，再用正丁醇-盐酸法测定其吸光度，从而确定提取松针原花青素的原料处理方式。
实验结果如表1所示。
正丁醇-盐酸法：
将待测样品配制成浓度为0.1g/L的甲醇溶液,取其1ml移入50ml圆底烧瓶中,然后依次加入0.2ml2%的硫酸铁铵溶液（用2mol/L的盐酸配制）和6ml正丁醇-盐酸溶液（正丁醇:
浓盐酸=95:
5,v/v）,摇匀。
反应液于95℃水浴中冷凝回流40min后,迅速冷却,在546nm波长处测定其吸光度，以吸光度大小判定样品中原花青素含量。
表1松针不同处理方式的吸光度比较
处理方式
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
平均值
新鲜沥干
3.523
3.518
3.531
3.524
自然晾干
1.621
1.632
1.615
1.623
烘箱烘干
2.562
2.573
2.554
2.563
由表1可知，新鲜松针中原花青素含量显著高于自然晾干和烘箱烘干的。
故以新鲜松针为工艺优化的原料。
自然晾干和烘箱烘干原花青素含量低的原因可能与原花青素易氧化有关。
2.3.2松针中原花青素的提取关键技术研究
（1）单因素试验
在其他条件一致的情况下，研究了不同的提取温度、提取时间、pH及料液比对水提取松针中原花青素的影响。
①提取温度对松针中原花青素提取率的影响
取20g等量的新鲜松针于5个500ml烧杯中，加入180ml的自来水，在功率为500W的微波炉中辅助提取时间15min，然后取出分别置于60℃，70℃，80℃，90℃,100℃的恒温水浴锅浸提1h,然后真空抽滤，滤液用石油醚除酯，弃醚层再用乙酸乙酯萃取后，置于旋转蒸发仪浓缩后，再用正丁醇-盐酸法测定其吸光度。
②提取料液比对松针中原花青素提取率的影响
取20g等量的新鲜松针于5个500ml烧杯中，分别按照料液比为1：
6，1：
8，1：
10，1：
12，1：
14加水，然后置于功率为500W的微波炉中辅助提取时间15min，然后取出置于80℃的恒温水浴锅浸提1h,然后真空抽滤，滤液用石油醚除酯，弃醚层再用乙酸乙酯萃取后，置于旋转蒸发仪浓缩后，再用正丁醇-盐酸法测定其吸光度。
③提取pH值对松针中原花青素提取率的影响
取20g等量的新鲜松针于5个500ml烧杯中，分别按照料液比为1：
9加入pH为4，6，8，10的水，然后置于功率为500W的微波炉中辅助提取时间15min，然后取出置于80℃的恒温水浴锅浸提1h,然后真空抽滤，滤液用石油醚除酯，弃醚层再用乙酸乙酯萃取后，置于旋转蒸发仪浓缩后，再用正丁醇-盐酸法测定其吸光度。
④提取时间对松针中原花青素提取率的影响
取20g等量的新鲜松针于5个500ml烧杯中，加入180ml的自来水，在功率为500W的微波炉中辅助提取时间15min，然后取出分别置于80℃的恒温水浴锅浸提30min，60min,90min，120min，150min，180min，再真空抽滤，滤液用石油醚除酯，弃醚层再用乙酸乙酯萃取后，置于旋转蒸发仪浓缩后，再用正丁醇-盐酸法测定其吸光度。
（2）正交试验
在上述单因素实验的基础上，以原花青素吸光度为指标，采用正交表L9（34）进行优化正交实验，因素水平选取及结果如表2所示。
表2正交实验因素和水平
因子/水平
A料液比/（g.mL-1）
B温度/℃
C提取时间/min
DpH
1
1：
10
80
90
4
2
1：
12
90
120
6
3
1：
14
100
150
8
3结果与分析
3.1单因素试验结果和分析
3.1.1提取温度对松针中原花青素提取率的影响
温度主要影响分子的热运动,温度低时,分子运动缓慢,溶解度随着温度的增加而增加,当温度过高时,溶液的氧化速度过快,从而影响原花青素的提取率。
提取温度对松针中原花青素提取率的影响结果如图4。
由图4可以看出原花青素的提取率在提取温度60～100℃内随温度的增加而增加。
随着提取温度的升高，原花青素的提取效果增强。
因为温度升高，分子运动速度加快，渗透、扩散、溶解速度加快，同时高温可以引起细胞膜结构的变化，使原花青素由松针的外层细胞转移到溶剂中，但是高温也使原花青素的结构被氧化破坏，导致其提取效果下降。
故选择合适的温度对实验起着至关重要的作用。
由图4可知，温度100℃时,原花青素的提取效果较优。
3.1.2提取料液比对松针中原花青素提取率的影响
由图5可知，随着料液比的增加，原花青素的提取率随之提高。
。
当料液比增大到一定程度时，提取效果趋于稳定，即一定比例的溶剂已将有效成分基本溶出完全。
考虑到后续加工中浓缩的成本，液料比选择不宜过高。
由此可见，料液比为1:
14时,原花青素的提取效果较优。
3.1.3提取pH对松针中原花青素提取率的影响
由图5可知，原花青素在偏酸性的环境下较稳定，在pH值为4左右提取效果较好，以后随着pH值的增加，含量反而下降，这是因为花青素在碱性条件下不稳定，
原花青素发生了降解，已经生成了其他物质。
因此，原花青素在使用和加工时应在弱酸性介质中进行，故以pH值为4时提取效果最好。
3.1.4提取时间对松针中原花青素提取率的影响
由图4可知，原花青素提取效果随时间不同而不同。
当提取达到一定时间时，松针中的有效成分浓度达到平衡，提取效果最好；随着时间的进一步延长，其提取效果有所下降，因为原花青素在溶液中长时间受热可能使部分酚结构被破坏；但是，如果提取时间过短，原花青素则不能很快从龙葵果细胞中溶出。
因此，提取时间以150min为宜。
3.2正交试验结果与分析
3.2.1正交实验结果及极差分析
以料液比，提取温度，提取时间，提取pH四因素设置的三水平正交实验及结果如表3所示。
由表3中的极差R大小可知，各因素对松针中原花青素提取率的影响顺序为：
提取温度＞提取时间＞料液比＞提取pH，故在实验过程中R值大的因素要引起充分的重视，以免影响实验结果的准确性。
由K值可知，从松针中提取原花青素的最好设计方案为A3B3C3D1,即最佳工艺条件为：
pH=4,提取温度=100℃,提取时间150min,料液比1：
14。
表3正交试验设计方案和结果
试验号
A
料液比/（g.mL-1）
B
温度/℃
C
提取时间/min
D
pH
吸光度
1
1
1
1
1
6.402
2
1
2
2
2
7.361
3
1
3
3
3
9.602
4
2
1
2
3
6.721
5
2
2
3
1
8.004
6
2
3
1
2
8.963
7
3
1
3
2
7.685
8
3
2
1
3
7.041
9
3
3
2
1
9.626
K1
23.365
20.808
22.406
24.032
K2
23.688
22.406
23.708
24.009
K3
24.352
28.191
25.291
23.364
k1
7.788
6.936
7.469
8.011
k2
7.896
7.469
7.903
8.003
k3
8.117
9.397
8.430
7.788
极差R
0.987
7.383
2.885
0.668
3.3最佳提取工艺验证实验
为验证所选工艺为最佳优化工艺,在最优条件下进行了3次平行实验,所得湿地松松针原花青素的提取率见表4。
表4最佳工艺条件下松针原花青素的吸光度
实验序号
吸光度
1
10.785
2
10.689
3
10.625
平均值
10.699
标准差
0.066
由表4可以知道,A3B3C3D1条件下松针原花青素的得率确实高于表3中每一项实验结果,确定A3B3C3D1为最佳工艺优化组合。
4结论与展望
通过单因素实验和正交实验，确定用微波水提法从松针中提取原花青素的最佳提取工艺条件：
提取温度为100℃,提取时间为150min,pH为4.0,料液比为1：
14,该条件下松针中原花青素的吸光度为10.566。
微波辅助从松针中提取原花青素具有省时、高效、节能等优点,且提取物更易于分离纯化。
对同类物质的提取有很大的参考价值。
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