Neon细胞电转仪中文说明书MPK5000.docx

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Neon细胞电转仪中文说明书MPK5000

Neon-细胞电转仪中文说明书（MPK5000）

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显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。

6.不含Ca2+和Mg2+的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）

流程：

1.用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和BufferE2，100μLNeon®Tip）填充电转杯。

（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。

）

2.将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。

确保Neon®管的侧面电极与Neon®移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）

3.在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％汇合。

4.对于大多数优化协议，每10μLNeon®Tip可提供5×104-2×105个细胞。

（5×105-2×106个细胞每100μLNeon®Tip适用于大多数优化的方案。

）

5.将含有血清，PBS（不含Ca2+和Mg2+）和胰蛋白酶/EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37℃。

从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2+和Mg2+）冲洗细胞。

使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLEExpress（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。

取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。

将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400×g离心细胞5分钟。

通过在室温下以100-400×g离心5分钟，用PBS（不含Ca2+和Mg2+）清洗细胞。

吸出PBS并以1.0×107个细胞/mL的最终密度将细胞沉淀重悬于ResuspensionBufferR中。

轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。

避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。

可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。

6.通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预培养板。

如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。

7.对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。

使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液

8.使用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip）装入Neon®移液管

9.根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件

10.将适量的质粒DNA/siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。

11.将细胞加入到含有质粒DNA/siRNA的管中，轻轻混合。

请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。

12.要将Neon®Tip插入Neon®移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具

13.将Neon®移液器的顶部插入Neon®Tip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）

14.轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。

注意：

确保Neon®移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接

15.将Neon®移液器上的按钮按到第一站，并将Neon®Tip浸入细胞DNA/siRNA混合物中。

缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA/siRNA混合物吸入Neon®Tip。

在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。

如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。

16.将带有样品的Neon®移液器垂直插入放置在Neon®移液器站中的Neon®Tube，直至听到咔嗒声。

确保移液器突起插入吸液管的槽中。

17.确保Neon®移液器的金属头与Neon®移液器支架内的球形活塞和Neon®Tube（见左图所示的正确位置）紧密连接。

18.在传送电脉冲之前，Neon®设备会自动检查Neon®Tube和Neon®Pipette是否正确插入。

19.在电穿孔期间监测Neon®Tip，以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧（火花）。

电弧导致转染效率低，细胞活力低。

20.交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete”以指示电穿孔完成。

21.从Neon®移液器站慢慢移除Neon®移液器，并立即从Neon®Tip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养基中。

22.我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。

23.要放弃Neon®Tip，请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。

24.对剩余的样品重复步骤7-16。

使用两次后，请务必更换Neon®Tips，并在10次使用后更换Neon®Tubes。

每个新的质粒DNA样品使用新的Neon®Tip和Neon®Tube

25.轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。

在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。

注意

1.如果您没有使用Neon®设备，将后面的电源开关转到OFF位置。

2.避免在Neon®移液器台内溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。

3.如果您不小心将任何液体（如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon®移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。

倒置并允许车站在室温下完全干燥24小时。

优化流程

1.确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA，并制备含有0.5mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。

准备足够的细胞和质粒DNA/siRNA进行至少30次转染。

2.对于使用24孔格式的10μLNeon®Tip的每个电穿孔样品，请参见下表。

对于以24孔格式使用100μLNeon®Tip，请将下表中列出的数值适当调整10倍。

3.使用3mL电解缓冲液（将缓冲液E用于10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip）置于含有细胞DNA/siRNA混合物的Neon®移液站中，如第15页所述。

4.按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。

5.电穿孔后，立即取出Neon®移液器，将样品从10μLNeon®Tip中转移到预热的0.5mL培养基中。

6.对于100μLNeon®Tip，将稀释样品在900μL培养基中稀释10倍，并将100μL样品转移至0.4mL预热培养基中。

7.对剩余的样品重复步骤3-5。

8.轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。

在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。