Westernblot试剂配制及操作流程.docx
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Westernblot试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程
试剂配制
蛋白提取试剂
1.RIPA裂解液:
50mMTris(MW121.14,PH7.5)3.02g
150mMNaCl4.38g
1%TritonX-1005ml
1%脱氧胆酸钠5g
0.1%SDS0.5g
蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存,长期保存于-20℃。
使用时,加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2.蛋白酶抑制剂cooktail
所需母液成分:
(1)100mmol/LPMSF
PMSF17.4mg
异丙醇1ml
溶解后,分装于1.5ml离心管中,-20℃保存。
(2)10mM亮肽素leupeptin:
-20℃保存
(3)2.1mg/ml抑肽素Aprotinin:
4℃保存
配制:
成分终浓度每ml裂解液所加母液量
PMSF1mmol/L(储存浓度稀释100倍)10ul
Leupeptin0.1mmol/L(储存浓度稀释100倍)10ul
Aprotinin1ug/ml(储存浓度稀释2000倍)0.5ul
各成分直接加入所用的RIPA裂解液中,之后按照60ul/孔(12孔板)提取蛋白。
蛋白定量试剂
1.G250考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用)
考马斯亮蓝G250100mg
95%乙醇50ml
85%磷酸100ml
蒸馏水至1000ml
配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4℃保存于棕色瓶中。
2.牛血清白蛋白BSA储存液(1mg/ml):
100mgBSA粉末溶于20ml双蒸水,定容至100ml,加少量防腐剂,4℃保存。
上样用试剂
1.4X上样缓冲液
1.0mol/LTris·HCl(pH6.8)2ml
SDS0.8g
溴酚蓝0.04g
甘油4ml
去离子水定容至10ml。
混匀后,分装于1.5ml离心管中,4℃保存。
使用时稀释成1X。
2.1.0mol/L二硫苏糖醇(DTT)(10X)
用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09gDTT,分装成1ml小份储存于-20︒C。
使用时稀释成1X。
例如:
上样量20μl--4X上样缓冲液5μl+DTT2μl+样本蛋白13μl
工作液
制胶用(1-6):
1.1.0mol/LTris·HCl(pH6.8)
Tris(MW121.14)12.114g
蒸馏水100ml
溶解后,(用浓盐酸调pH至6.8),室温下保存。
2.1.5mol/LTris·HCl(pH8.8)
Tris(MW121.14)18.671g
蒸馏水100ml
溶解后,(用浓盐酸调pH至8.8),室温下保存。
3.10%SDS
SDS10g
蒸馏水至100ml
如溶解困难,可在50℃水浴下溶解,室温保存。
如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
4.10%过硫酸胺(AP)
过硫酸胺0.1g
蒸馏水1ml
(现用现配,可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中,一次性多装几管,使用时加入蒸馏水水即可,溶解后,4℃保存,保存时间为1周)
5.四甲基乙二胺原液(TEMED):
4︒C保存。
6.30%丙稀酰胺:
4︒C保存。
10%下层胶(两块胶,15ml):
依次加入去离子水5.9ml
30%丙烯酰胺5ml
1.5MTris-HCl(pH8.8)3.8ml
10%SDS150μl
10%AP150μl
TEMED6μl
每加一种成分随即摇匀,为了加快凝胶,可以将过硫酸胺和TEMED量加大,根据实验当时的温度适当调整,加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加正丁醇(1ml)消泡
5%上层胶(两块胶,6ml):
依次加入去离子水4.1ml
30%丙烯酰胺1ml
1MTris-HCl(pH6.8)0.75ml
10%SDS60μl
10%AP60μl
TEMED6μl
每加一种成分随即摇匀,为了加快凝胶,可以将过硫酸胺和TEMED量加大,根据实验当时的温度适当调整,加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
7.5X电泳液缓冲液
Tris(MW121.14)15.1g
甘氨酸(MW75.07)94g
SDS5.00g
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍,通常取160ml配制成800ml即可。
8.10X转膜缓冲液
甘氨酸(MW75.07)151.1g
Tris(MW121.14)30.3g
蒸馏水至1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍,并加入甲醇至20%。
通常取80ml母液,加560ml蒸馏水,最加160ml甲醇,配制成800ml即可。
(先加甲醇易产生沉淀)
9.10XTBS缓冲液
Tris(MW121.14)24.2g
NaCl80.0g
蒸馏水至1000ml
(浓盐酸调pH至7.6),溶解后室温保存。
10.1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液100ml
蒸馏水900ml
Tween-201ml
因Tween-20比较粘稠,应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块,即可防止产生气泡。
溶解后室温保存。
11.封闭液/抗体稀释液(5%脱脂牛奶):
1XTBST缓冲液95-100ml
脱脂奶粉5g
溶解后4℃保存,可于一周内使用。
其他商品性试剂
一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂
操作步骤
(一)蛋白样品制备
(1)单层贴壁细胞总蛋白的提取:
1、倒掉培养液,将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液,(暂不作可将培养皿存于-80度)。
2、向培养皿中加入裂解液,通常6孔板150-200ul/孔,12孔板50-60ul/孔,冰上放置,摇床20min
3、用勺子刮下细胞,并吸出液体至1.5ml离心管中,勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干(注意冰上操作)
4、超声处理(可选)注意蛋白悬液放于冰上,15sec处理,dutycycle50-60每次处理后清水洗探头、擦干,再作下一个
5、于4℃下12000rpm离心5min。
6、将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80℃保存。
(2)组织中总蛋白的提取:
1.将200mg组织块剪碎,置于1ml裂解液中(5ml离心管)。
2.匀浆器进行匀浆,注意冰上操作,匀浆后置于冰上。
3.10,000g,4℃,10min,(5ml管)
4.取上清至1.5ml管,12,000g,4℃,60min,
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
(二)蛋白含量的测定
1、从-20℃取出1mg/mlBSA,室温融化后,备用。
2、取7个5ml离心管,分别加入1mg/mlBSA:
0、10、20、40、60、80、100ul,用蒸馏水补足各管至100ul。
3、样本取5ul,加蒸馏水95ul,使总量亦为100ul,混匀。
4、各管加G-250溶液2ml混匀,室温静止2分钟。
5、混匀后,在生物分光光度计上比色分析,测定595nm的光吸收,测定时浓度由低到高。
6、于Excel根据标准品绘制标准曲线,根据得出的公式计算样本浓度。
(三)SDS-PAGE电泳
(1)清洗玻璃板:
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
(2)灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边)
2、按前面方法配10%下层胶(15ml,两块胶,每块胶在6.5ml左右),加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶后胶上加一层正丁醇(1ml左右),液封后的胶凝的更快。
3、当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。
弃去正丁醇,用水冲洗,并用吸水纸将水吸干。
4、等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量(根据自己的实验需要进行选择,没有固定的量),目的蛋白GluT3一般在20-30μl左右。
取出上样样品至200μl的EP管中,加入4×上样缓冲液及DTT至终浓度均为1×(上样总体积一般不超过30μl)。
上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性(亦可以使用PCR仪进行变性,加快速度,这样就不用将水煮沸了)。
5、按前面方法配5%的上层胶(6ml,两块胶),加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中(从梳子的一头开始插)。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小(也提示胶已经凝固),从而使加样孔的上样体积减小,所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶(不补胶问题也不大)。
等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘(量要足够多),否则电泳期间会出现电流过低的现象,进而影响电泳的效果。
7、上样(注意:
最外两泳道易跑歪,尽量不用。
)
Marker6μl(Marker加在最边上的加样孔中)
样本20-30μl
实验所用Marker电泳后出现10条带:
10,15,25,35,40,55,70,100,130,170KDa
(3)电泳:
电压100V,电流300mA,功率50W,时间1.5hour。
(电泳15分钟后可调节电压到130V)
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜(一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好)。
电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。
(四)转膜
(1)转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套(因为手上的蛋白会污染膜)。
将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。
(2)夹子黑的一面:
海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵
将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
在垫子上垫二层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
)
先将玻璃板撬开,随后将浓缩胶轻轻刮去,小心剥下下层胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
将硝酸纤维素膜盖于胶上,要盖满整个胶并除气泡。
在膜上盖2张滤纸并除去气泡(膜盖下后不可再移动)。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
如果同时做两块胶,转膜的时候应记住样本的位置。
(3)将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。
一般用100V转移1.5h。
✧实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间,对于小分子量的蛋白,转膜时最好垫两块硝纤膜,以免转膜过头,因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了,第二张膜上还有蛋白质可以进行检测;对于大分子量的蛋白,转膜时电压要高一点,一般80-100V,时间也要延长一点,开始最好也用两块膜,特别是务必注意加强降温措施。
当然转膜是要摸条件的,最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。
如果由于时间原因来不及做下面实验,可以在4度下12V转膜过夜;
✧硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜,不容易转膜过头;
✧不同的转膜装置,转移效率是不一样的,所以换用转膜装置,最好再摸个条件;
✧转膜时电极方向注意是膜正胶负。
如果同时做两块胶,转膜结束应在膜上做标记,以便查询相应样本。
转膜结束前配制封闭液(5%脱脂牛奶)及1XTBST缓冲液。
(五)免疫反应
(1)封闭:
将膜用移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
(2)一抗
a.用parafilm膜制作与膜大小相同的槽;
b.从封闭液中取出膜,1XTBST5minX3次;
c.将一抗用封闭液稀释至适当浓度(目的蛋白GluT31:
300,actin1:
2000);
d.将膜蛋白面朝上放于槽中,加入抗体,室温下孵育1-2h后(目的蛋白GluT31.5h,actin1h),4度过夜,次日用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min。
(3)二抗
同上方法准备二抗稀释液(目的蛋白GluT31:
1000,actin1:
1000)并与膜接触,室温下孵育1h后,用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次10min。
(六)化学发光,显影,定影
(1)将A和B两种试剂等量(常用各500μl)在5ml离心管中等体积混合;
打开X-光片夹,铺上保鲜膜,将NC膜面朝上放于保鲜膜上,滴加此混合液1-3min后(见到荧光),用保鲜膜包好。
(2)将1×显影液,自来水和定影液分别到入盘中;
在红灯下
✧取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm);把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min到5min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;
✧曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。
显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;
✧显影结束后,先用自来水洗一下X-光片,然后再放到定影液中进行定影(这样可以延长定影液使用时间,从而节约定影液)。
定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;
(七)凝胶图象分析:
将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。