染色体数目在拟南芥及其相近的十字花科植物中减少的机制.docx

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染色体数目在拟南芥及其相近的十字花科植物中减少的机制

染色体数目在拟南芥及其相近的十字花科植物中减少的机制

染色体组进化可以由基因组测序、比较遗传图谱和比较染色体涂色来解析。

此前，比较遗传图谱和基于基因的系统发育暗示，拟南芥（n=5）和具有6或7对染色体的近缘物种的核型都均来自同一个具有八对染色体的原始染色体核型。

为了检验这一假说，我们对拟南芥（Arabidopsisthaliana）、琴叶拟南芥（Arabidopsislyrata）、球果芥（Nesliapaniculata）、旗杆芥（Turritisglabra）和Hornungiaalpina应用多色染色体涂染，而此涂染是基于根据琴叶拟南芥（A.lyrata）和芥菜（C.rubella）（两者n=8）遗传图谱排列的拟南芥的连续细菌人工染色体库。

这种方法使我们能够以定位琴叶拟南芥着丝粒作为一个假定前提来定义一般的原始核型（n=8），并阐明拟南芥及其近缘种染色体核型形成的进化机制。

我们得出结论，造成拟南芥染色体“融合现象”的原因有

（一）近端着丝粒染色体由臂间倒位产生

（二）两条染色体之间相互易位（一或两者近端着丝粒），（三）除聚变染色体以外，出现的微小染色体的淘汰。

无可利用遗传图谱的球果芥（n=7）、旗杆芥（n=6）和Hornungiaalpine（n=6）的比较染色体涂染显示出所有测试物种之间的染色体共线性，从而允许我们重新构建它们自一般祖先核型（n=8）而来的染色体的进化。

虽然涉及不同的祖先染色体，染色体数目减少却遵守着在拟南芥属中发现的相似途径。

染色体涂染基因组的部分同源配对核型进化基因组共线性系统发生

真核生物特异的染色体组——核型，可能会有所不同的数目，大小和染色体的形状，甚至在相关类群。

染色体大小和/或形状可以通过相互易位、倒置、插入或删除来改变。

在二倍体水平，易位杂合子由于减数分裂的不分离，或由于所谓的聚变/裂变事件（1，2），染色体数目可能会有所不同。

这种机制结合整个染色体组加倍（多倍体）在进化过程中就生成了现存的核型。

由于核型是动态的结构，在很好地描述现存的染色体核型的基础上，对祖先的染色体核型的重建对于了解核型变化的进化方向是必要。

原则上，基于对现存物种共享的染色体共线性的比较，有两种策略来发现假定的祖先核型和重建导致了目前核型的进化事件。

一种策略是比较遗传图谱，以稻科植物类为例证（3）；另一种是比较染色体涂染（CCP），成功地应用于脊椎动物（评论，见refs.4和5）。

十字花科的物种间，染色体数目从n=4变化到n=128（6）。

拟南芥属及其近亲属的基本染色体数目在5，6，7和8间变动，多数品种有8对染色体。

基于拟南芥（n=5）和琴叶拟南芥（n=8；refs.7和8）间以及拟南芥和荠菜（n=8；ref.9）间比较遗传图谱，和由DNA序列推断的系统发育树（10），就推断具有8条染色体的祖先核型。

有人建议，作为后代的拟南芥的染色体核型是经过祖先染色体的两次相互易位、三次染色体的融合和至少三次倒置后形成的（8，11）。

这里，我们利用比较染色体涂染，研究拟南芥与四种不同染色体数的十字花科植物间的染色体共线性（琴叶拟南芥，n=8；球果芥，n=7;旗杆芥,n=6;和Hornungiaalpina，n=6），该方法使用细菌人工染色体重叠群来覆盖拟南芥所有的染色体臂。

比较染色体涂染的结果同遗传图谱进行了比较，而该图谱是以基于多基因序列的系统发育关系为背景。

对琴叶拟南芥而言，染色体涂染证实了源自拟南芥和琴叶拟南芥遗传图谱（7，8）的基因组共线性模式。

此外，至于祖先核型内着丝粒的位置和特异的倒置和易位事件在染色体数目从n=8到拟南芥的n=5的减少过程中的作用，我们提出一个新观点。

对于有6或7对染色体而没有可用的遗传图谱的三个品种，我们应用比较染色体涂染，发现了在这些物种和拟南芥间染色体共线性的程度。

与祖先的染色体核型进行比较，我们确定了和染色体数目减少相关联的事件。

结果

染色体涂染确认及指定形成拟南芥染色体核型的进化事件。

为了找到与琴叶拟南芥连锁群（LGs）（7，8）对应的染色体上的位置，多色比较染色体涂染被应用于其粗线期染色体。

根据各自标记为一个二价染色体的8个连锁群排列拟南芥细菌人工染色体重叠群（图1B）。

琴叶拟南芥核型的所有着丝粒和五个核仁组织区（在1、3-5和7号染色体短臂上）的位置已被确定（图1B和D-F）。

因为琴叶拟南芥的连锁群琴主要对应于那些相对远源的芥菜（11），所以两者的核型应该是类似于整个拟南芥属世系的祖先染色体核型。

图1.拟南芥（n=5）染色体核型的进化，基于琴叶拟南芥（n=8）比较染色体组涂染。

（A）导致染色体数量减少的事件，从一个N=8对染色体的祖先到拟南芥染色体核型的进化过程中。

倒置（I）、易位（T）和融合事件（F），以及Koch和Kiefer估计的分歧时间（11）。

只有AK4连续的臂内倒位和臂间倒位（Ipa/Ipe）是最新提出的。

需要明显时间顺序的事件被排列在一起。

（B）琴叶拟南芥核型的染色体模式图。

基于核仁组织区（黑球），所有染色体对应于祖先核型。

（C）拟南芥核型的染色体模式图表示出源自祖先核型（B）的染色体AT1到AT5的构成，以及在A图中有关染色体数目减少的事件。

（D–F）基于琴叶拟南芥的连锁群而排列的拟南芥细菌人工染色体重叠群，涂染拟南芥（AT1-5）和琴叶拟南芥（AK1-8）的粗线期染色体，并根据B图绘假彩色；空方/箭头指出着丝粒区域。

（D—F比例尺：

5μm。

）

为了达到在拟南芥5条染色体上可视化来自具有8对染色体（AK1-8）的祖先核型的组件的目的，按照琴叶拟南芥全部或部分的连锁群排列的细菌人工染色体基因库被用于多色涂染（图.1C–F和2A）。

涂染拟南芥1号染色体（AT1）的探针杂交到琴叶拟南芥的两条染色体，它们对应于同比较作图结果匹配的连锁群1和2。

覆盖AT1下臂的远端部分并且和第二连锁群（LG2）同源的细菌人工染色体重叠群，标记了琴叶拟南芥的整个AK2染色体（图.1D）。

利用三种不同标记的亚重叠群细分针对LG2的探针，发现一次倒置组成了AK2的上臂（短臂）（图.2A）。

此倒置在芥菜以及最近也在琴叶拟南芥的遗传图谱中发现。

因为在AT1的“融合点”没有发现染色体AK2的着丝粒和端粒序列（13），我们认为臂间倒位将AK2转换成一个近端着丝粒染色体。

紧接这次倒置事件，在AK1的短臂末端和AK2的中心区末端发生一次相互易位，从而形成AT1（图.2B）。

第二个非常小的易位产物，主要包括来自AK1和AK2端粒重复序列以及AK2的着丝粒，发生丢失，很可能是因为在减数分裂过程中未能配对，并且缺乏适当的必需基因。

利用基于琴叶拟南芥3、4和5连锁群设计的探针，标记染色体AT2和AT3（图.1E）。

因此，AT2包括AK5上臂的末端部分，AK3下臂近中部的部分、着丝粒和上臂（短臂），以及整个AK4（无着丝粒）。

AT3的同源部分包括AK5的下臂、着丝粒和部分上臂，以及AK3下臂的大部分（图.1C）。

如前所述（7,8,11），我们的数据表明，AT2和AT3的着丝粒保留在同AK3和AK5相同的位置上，并确认染色体AT2和AT3是由AK3和AK5间的相互易位形成的。

包括上臂在内，利用能细分区域的基因库进行荧光原位杂交，没有发现AK4有臂间倒位。

然而，构成整个短臂的一次臂内倒位以及随后一次臂间倒位，就产生了近端着丝粒染色体AK4，它同通过相互易位形成AT2的AK3/5融合，而不会打断对应于LG4的共线性。

第二个小型易位产物，由AK4的端粒和着丝粒组成的，发生了丢失（图.2C）。

利用基于琴叶拟南芥LGs6、7和8设计的探针，标记染色体AT4和AT5（图.1F）。

AT4的同源部分包括AK6的上臂（短）和AK7的下臂。

染色体AT5包括AK6的下臂（长）、AK7的上臂（短）以及整个AK8（无着丝粒）。

发生在染色体AK6和AK7之间明显的相互易位，是走向染色体AT4和AT5的第一步（图.2D）。

AT4长臂的倒位最初由遗传图谱发现（8，9），并且可以被CCP证实。

这次明显的臂间倒位（14）同AK6和AK7间的易位，可能同时发生，或者在其之后。

对比芥菜连锁群H（8,9,11），在AT5下臂上的另一次倒位最初产生一个来自AK8的近端着丝粒染色体。

最后，一次相互易位将这个近端着丝粒染色体同AK6/7融合，形成AT5（图.2D）。

因此，这次融合同形成AT1（图.2B）的融合遵循着相同的途径。

CCP揭示染色体数目减少的模型，而这些物种是缺少遗传图谱的。

为了阐明从假定的祖先核型到球果芥、旗杆芥和H.alpine（所有n<8）的核型进化,利用基于琴叶拟南芥/芥菜的8个LGs（或其中特定的区域）排列的BAC基因库，进行CCP。

图.3A1显示重构的球果芥（n=7）核型。

基于参考每个LGs1-3和LGs6-8而设计的探针，用来标记单个粗线期二价体或者有丝分裂的染色体对（图.3A3-A5）。

利用对应LG8的探针进行CCP，揭示一个近端着丝粒染色体，它的短臂明显包含45SrDNA（图.3A6）。

对应LG4和LG5的探针各自标记相同染色体的一臂（图.3A4）。

利用LG4和LG5差异标记的BAC基因库，进行FISH，推测在发生相互易位之前AK4存在一次臂间倒位，使它成为近端着丝粒染色体，而这次易位融合LG4和LG5，并产生主要由着丝粒和端粒序列组成的不必要的微小染色体（图.3A2）。

因为我们在AK5中未发现倒位，在臂间倒位之前，包括其短臂在内的一次臂内倒位产生一个同经修饰的AK4融合的近端着丝粒染色体AK5（没有打断对LG5的共线性），这类似于形成AT2的AK3和AK4间的融合（图.2C）。

图.2.拟南芥融合染色体的重新构建。

（A）利用覆盖琴叶拟南芥LG2的经差异标记的BAC基因库，涂染琴叶拟南芥的AK2染色体和拟南芥的AT1染色体。

结果表明，在向拟南芥进化过程中，一次臂间倒位发生在AK2同AK1融合之前。

空方/箭头指示着丝粒区域。

（比例尺：

5μm）（B）融合染色体AT1的起源。

AK2发生一次臂间倒位，随后发生一次相互易位，其断点是AK1短臂的末端以及AK2的近着丝粒（近端着丝的）处。

（C和D）推测拟南芥染色体AT2-5的起源。

（C）染色体AT3起源于AK3和AK5间的相互易位。

融合染色体AT2是由AK3/5和近端着丝粒染色体AK4易位后生成的。

在解释AT2起源时，推测AK4发生了一次臂内倒位（Ipa）和一次臂间倒位（Ipe）。

（D）AT4的形成过程包括AK6和AK7间的相互易位以及随后的臂间倒位；此外，它还得到一个核仁组织区。

显示的是AK8臂间倒位形成近端着丝粒染色体，及随后同AK6/7的短臂发生易位形成AT5。

图B-D中产生的微小染色体是第二类易位产物，它们不是必须的，最后丢失了。

据推测，祖先染色体在同琴叶拟南芥相同的位置上具有核仁组织区（空心球）；实际在拟南芥中发现的核仁组织区描绘成黑球。

倒置（I）、易位（T）和融合（F）列举在图1中。

对于旗杆芥（n=6）而言，基于对应的LGs1、4、6和7分别设计探针标记一个单独的粗线期二价染色体（图.3B1和4）。

对应LGs2和8的探针涂染一个单条染色体（AK2/8）。

这条染色体含有着丝粒的部分源自AK2，它的形成过程包括一次臂间倒位，得到AK8近端着丝粒染色体，和随后AK2和近端着丝的AK8发生的一次相互易位（数据未显示）。

微小的不必要的易位产物就丢失了。

第二条融合的染色体对应AK3和AK5。

它产生于包含AK3短臂在内的一次臂间倒位之后，是由AK3着丝粒和AK5短臂末端间的一次相互易位的结果。

差异涂染两种祖先染色体短臂的亚区域，揭示出融合染色体AK3/5（图.3B2）发生过一次臂内倒位。

此外，差异涂染还发现一次臂内倒位发生在与AK7对应的染色体的下（长）臂上（图.4）。

对H.alpina（n=6）而言，利用基于LGs1、3、4和7设计的探针分别标记一个单独的粗线期二价染色体。

显然，再同AK6进行相互易位发生融合之前，AK8曾经过一次臂间倒位变成近端着丝粒染色体。

一次臂间倒位和随后一次臂内倒位发生在融合染色体的长臂内，这条染色体含有来自两个祖先染色体的区域（图.3C2）。

AK2和AK5的结合是通过易位实现的，AK5的一条臂被移到AK2的一端，AK5的另一条臂被移到AK2的另一端（图.3C1和图.5，发表在PNAS网站上作为支持信息）。

系统发育树表明8对染色体的祖先核型经常发生染色体数目减少

4个独立基因位点的系统发育分析支持大体上一致的种系发生。

为了可视化基因树间的相容性程度，应用Z-闭合规则将四个基因树整合为单个的超级线路网（ref.15，图.4，和图.6，发表在PNAS网站上作为支持信息）。

推断的系统发育关系以前发表的结果（10,16），H.alpina同拟南芥相距最远。

拟南芥属和芥菜属类似的核型支持这样的观点，即琴叶拟南芥和芥菜的核型类似于假定的8对染色体的祖先核型。

我们的数据推断，假定的祖先核型（n=8）出现要早于薄果芥属同拟南芥属-芥菜属-旗杆芥属进化枝的分离。

此外，将重新构建的核型置于系统发育树中后，发现在分析的4个世系内染色体数目的减少是独立的且经常性的过程，大多情况包括不同的祖先染色体。

讨论

同比较遗传图谱的结果一致（7-9,11），我们利用基于琴叶拟南芥和芥菜（被认为大体上代表了拟南芥和其近亲的祖先核型）的连锁群排列的探针对拟南芥粗线期染色体进行多色染色体涂染，检测到所有的倒位、易位和融合事件，而它们显著地导致了拟南芥核型的进化。

更重要地，我们对拟南芥应用最小重叠关系BAC进行染色体涂染，进而定位着丝点及界定染色体倒位和易位，它比低或中等标记密度的比较图谱的推断要更精确。

对于下列事件，导致拟南芥染色体数目减少的染色体重排的时间顺序是固定的（图.1A和C，图.2，ref.11）:

倒位1→融合3，得到AT1；易位1→倒位2（和3）→融合1，得到AT4和AT5；易位2→AK4臂内倒位和臂间倒位→融合2，得到AT2和AT3。

然而，每组关联事件之间的发生先后是不确定的。

在AK8参与融合形成拟南芥、旗杆芥和H.alpina之前，AK8起初究竟是近端着丝粒染色体，就像在球果芥中短臂明显只包括45SrDNA（图.3A6）,还是亚中间着丝粒染色体，就像在琴叶拟南芥和芥菜中，这是不清楚的。

两类假定都推断AK8有重复的臂间倒位。

图.3.球果芥（n=7）、旗杆芥（n=6）和H.alpina（n=6）的染色体组型及涂染的染色体。

给染色体涂色，根据其同祖先核型（AK1-8；见图1）的共线性，如图A1、A3-A5、B1和C1；或者根据使用差异标记的BAC亚重叠群进行的CCP（A2-C2）。

（A3-A5）利用基于琴叶拟南芥的AK1-8染色体排列的拟南芥探针对球果芥实施CCP。

成对涂染的有丝分裂的染色体被插在A3-A5中。

图A2显示有关融合染色体AK4/5推测的起源以及此染色体的涂染。

（A6）对应染色体AK8的探针标记一条染色体的长臂，在另外一侧的异色臂间倒位区域只显示45SrDNA（绿色），因而表现为AK8的近乎近端着丝的同源物。

（B1和C1）旗杆芥（B1）和H.alpina（C1）重新构建核型后的染色体组型。

（B2和C2）旗杆芥融合染色体AK3/5（B2）和H.alpina融合染色体AK6/8（C2）推断的起源以及对应的涂染。

空方/箭头指示着丝粒区域，黑球表示实际的NORs，而空心球表示假定的NORs（见图.2）。

（比例尺：

5μm）。

此外，我们的研究表明，融合事件将基本染色体的数目从8条减少到5条，这个过程是基于中部/亚中部着丝粒染色体与近端着丝粒染色体间的相互易位，其中后者是由臂间倒位造成的。

除融合染色体外，由这些易位事件产生的微小染色体大概都丢失了。

此设想解释了拟南芥核型进化过程中着丝粒的消除以及可能丢失的末端NORs。

我们研究的一个重要发现是CCP可靠地发现拟南芥和较远源的物种间的染色体共线性，而这些远源物种没有可用的（比较）遗传图谱。

CCP使我们能够解释导致今天核型的染色体的重排和减少。

我们对三种此类物种的研究揭示主要是在拟南芥中发现的相同的机制引起了染色体数目的减少。

显著地，导致我们研究中26次重排的52次断点，84.6%涉及近端着丝粒染色体（24个断点）或者末端位置（20个断点），这些位置常聚集些重复序列。

同我们的观察一致，在端粒酶缺陷的拟南芥植物，末端NORs参与染色体重排的几率大约是随机情况下的10倍还多（17）。

图.4.所研究的5个物种及芥菜的染色体组型和超级线路网。

网络的边长对应进化距离（29）。

芥菜bursa-pastoris的基因序列被用来推断芥菜的系统发育位置。

琴叶拟南芥和芥菜的染色体被认为同祖先核型（AK1-8）类似。

共线性的染色体或染色体的部分区域描绘成相同的颜色。

红色和黑色的括号分别表示臂内倒位和臂间倒位。

一般来说，因为相同的染色体模式不可能在不同的系统发育世系内独立发生，所以染色体重排只表现低水平的相似。

当被不同物种共享时，这样的重排就代表着“稀有的基因组变化”，这类变化象征着系统发育的亲缘关系和共同祖先。

H.alpina和其余的物种共享祖先染色体模式，这点支持整个物种组有一个共同祖先的假设。

因此，染色体共线性在推断系统发育关系和/或在限定基于序列的系统发育构架方面有着巨大的潜力。

因为CCP被成功应用于芸薹族物种（19），所以它应该可应用于阐明十字花科内同拟南芥远源的属的染色体进化问题。

材料与方法

染色体的准备

准备的染色体分裂相标本（chromosomespread）来自：

A.thaliana（accessionsColumbiaandC24）,A.lyratasubsp.lyrata（BashBish,MA;cf.14）,H.（Pritzelago）alpina（AustrianAlpsMountains,lpengartenRannach,Austria）,N.paniculata（BotanicGarden,Copenhagen,Denmark;codeno.28,indexno.783,2001）and.（Arabis）glabra（Stangerode,HarzMountains,Germany）.表1发布在PNAS的网站上，其中列出了这个研究所有物种的详细信息。

收获长在温室的植物的整个花序，用6:

3:

1的乙醇：

氯仿：

冰醋酸固定一夜后，70%乙醇中-20℃下保存到使用。

选定的花序用蒸馏水和柠檬酸缓冲液（10mM的柠檬酸钠，pH4.8）冲洗。

适当大小的花芽被切除，放入含0.3%果胶酶、纤维素酶和细胞解旋酶（全是Sigma产）的柠檬酸缓冲液在37℃下保持3-5小时，再转移到柠檬酸缓冲液在4℃下保存直到使用。

一些单个花芽放在干净的载玻片上，滴一滴柠檬酸缓冲液，在体式显微镜下用针对其解体。

接下来，加10µl45%柠檬酸，在热板（50℃）上用针搅拌液滴0.5-2分钟。

搅拌时，加10-40µl45%柠檬酸。

接着，加100-200µl乙醇：

柠檬酸（3:

1）。

倾斜载玻片来去除固定剂，用吹风机吹干后，在相差显微镜下检查。

合适的载玻片用溶解在蒸馏水中的4%甲醛做固定后处理，至少10分钟后再风干。

探针标记、FISH和图像处理

从拟南芥生物资源中心（哥伦布，俄亥俄州）得到用于FISH的BAC克隆。

按如下方法，分离BACDNA选择适合染色体涂染的染色体特异的克隆（14,20）。

表2作为支持信息发表在PNAS网站上，显示图.1-3中用于CCP的BAC克隆，而染色体涂染使用的BACs的详细列表若有要求也可得到。

BAC克隆T15P10（AF167571）含有45SrRNA基因，被用于NORs的原位定位。

对比较涂染而言，BAC重叠群基因库的排列是基于A.thaliana/C.rubella（9）,A.thaliana/A.lyratasubsp.petraea（7）,orA.thaliana/A.lyratasubsp.lyrata（8）的比较遗传图谱。

LGs和琴叶拟南芥、芥菜及假定的AK的染色体的名称同Kuittinen等（7）和Koch与Kiefer（11）一致。

因此，染色体AK1-8分别对应琴叶拟南芥的LG1-8（7），以及芥菜的A-H（9）。

利用基于生物素-dUTP、地高辛-dUTP、二硝基苯（DNP）-dUTP或Cy3-dUTP（20）的缺口翻译（21）来标记BACDNA。

为了准备染色体涂染，标记的BAC被汇集、沉淀和重新悬浮在每张载玻片20-40µl的杂交混合液[20％或50％（拟南芥）甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，2×SSC，50毫摩尔磷酸钠（pH7.0）]

里。

标记的探针和染色体在80℃的热板上一同变性2分钟，接着在37℃的潮湿室孵育36-60小时。

杂交后清洗使用含50%甲酰胺（拟南芥）或20%甲酰胺（其他物种）的42℃的2×SSC。

荧光检测是如下进行的：

biotin-dUTP的检测包括avidin结合TexasRed（VectorLaboratories），goatanti-avidin结合biotin（VectorLaboratories），avidin再结合TexasRed；digoxigenindUTP的检测包括mouseanti-digoxigenin（RocheAppliedScience,Mannheim,Germany）和goatanti-mouse结合AlexaFluor488（分子探针）；DNP-dUTP的检测包括rabbitanti-DNP（Sigma）和goatanti-rabbit结合Cy5（JacksonImmunoResearch）。

Cy3-dUTP可直接观察。

对染色体用含µg/mlDAPI的Vectashield（VectorLaboratories）复染色。

在Axioplan2荧光显微镜（Zeiss）下，使用×100/1.4Zeiss平场复消色差物镜和致冷的电耦合装置相机（CCD）（（Spot2e,DiagnosticInstruments,SterlingHeights,MI）分析荧光信号。

使用适当的激发和发射滤波器（AHFAnalysentechnik,Lagenfeld,Germany）分别获得5个荧光染料的图像。

5个单色图像假彩色化并使用AdobePhotoshop6.0软件（AdobeSystems,SanJose,CA）合并。

8个假彩色描画祖先核型的8个连锁群/染色体。

基于DNA的系统发育的重建

得到遗传图谱分析或者CCP分析所涉及的每个分类单元的5个基因的核酸序列，以及还有Boecherastricta,

Camelinamicrocarpa,Crucihimalayawallichii,Lepidiumapetalum,Olimarabidopsispumila,Pachycladonnovae-zelandiae和Physariagracilis的相关序列。

这些基因的系统发育分析有助于评价这些物种间的无根系统发育树。

拟南芥序列来自GenBank（accessionnos.M64119,AY198405,X52320,andAP000423）。

本研究所有特有的序列都存放在GenBank（accessionnos.DQ310510-DQ310545）。

利用植物的Dneasyminikit（Qiagen,Valencia,CA）分离叶的基因组DNA。

PCR扩增5个基因并测序：

（i）编码细胞质甘油三磷酸脱氢酶（G3Pdh）的单拷贝基因（22）；（ii）编码FRIGIDA（FRI）的单拷贝基因（23）；（iii）转录间隔区的多拷贝（ITS），