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MP胶原酶说明书

目录编号：

100501，100502，150704，150705，151459，195109，195110

胶原酶

描述

胶原酶降解机螺旋胶原纤维。

对于广泛的审查和参考书目，请参阅：

哈里斯和克兰（1974），赛夫特和Harper（1970年和1971年）和Harper（1980年）。

的基板，胶原蛋白，动物细胞外结缔组织的主要纤维成分：

皮肤，腱，血管，骨等，其结构复杂，必须理解理解胶原酶溶解。

（见审查赛夫特疾驰，1966。

，罗伯逊和米勒（1972）上cartilagenous胶原。

）在简短的，由胶原纤维组成，横向聚集，极化原胶原分子（MW300,000）。

每个棒状原胶原单元由三个螺旋形缠绕的多肽称为α-链围绕一个轴。

股有重复的甘氨酸残基在每第三的位置和丰富的脯氨酸和羟脯氨酸。

的氨基酸序列为特征的组织来源。

原胶原单位结合均匀横向安排，反映了充电和不带电的氨基酸分子一起，从而创造轴向重复周期性（1968年Ninmi）。

相互联系，不断发展和胶原蛋白变得越来越不溶性和耐溶解老化（哈姆林等1975;哈里斯1972年法雷尔）。

另见PIEZ托尔基亚（1975），布伦斯和建筑（1973）和坦泽（1973）。

明胶的结果时，可溶性原胶原变性，例如，在温和加热下，多肽链成为随机地分散。

在这种状态下，股线很容易受到各种各样的蛋白酶切割的。

真胶原酶可切割攻击一个单链（赛夫特和哈珀1970年），同时在所有三个链或酶结缔组织代谢具有重要作用，（德累斯顿1971年），并参与维修和改造过程（Wahl等所产生的特定的细胞人1975;Robertson等人1972;Sakamoto等人1975A）。

表我在审查由赛夫特和Harper（1971）列出已知的胶原酶。

在正常条件下的哺乳动物酶绑定2-巨球蛋白或其它血清抗蛋白酶（爱森等人1971）。

凡酶是在产后子宫功能，它可能直接从组织匀浆（Ryan和Woessner1971）通过以下方式获得。

哺乳动物的胶原酶分裂胶原蛋白在其原生的三螺旋构象，在一个特定位置，产生碎片，三氯乙酸和TCB，即3/4和1/4长度的原胶原分子。

（伍利等人，1975年b;Gross等1974）。

碎裂后的碎片往往解开成的无规卷曲多肽（明胶）。

第一个哺乳动物酶研究，从蝌蚪尾巴组织的文化。

（Nagai等人1966年SKAI和1967年建筑;Bauer等1971;哈珀等人1971;哈珀和1972年建筑）。

Bauer等人已报告了从人类和其他哺乳动物来源的胶原酶。

（1975年），布雷迪（1975），黄和艾布拉姆森（1975），坂本等人。

（1975A和b），Wahl等人。

（1985），伍利等。

（1975），Fujiwara等（1974），Gross等人。

（1974年），WERB和伯利（1974），坂本等人。

（1973），Woessner和Ryan（1973），常吕等人。

（1972年），罗伯逊和米勒（1972），瓦埃（1972年），Bauer等。

（1971），Donoff等。

（1971），爱森等人。

（1971年，1970年和1968年），瑞恩和Woessner（1971），拉撒路等。

（1968）。

切斯尼等。

（1974）报告对人体血小板胶原酶。

艾森等。

（1973年）的报告发现胶原酶在招潮蟹肝胰腺和菲利普斯和德累斯顿（1973）土地planarium中的。

此外，还存在细菌胶原酶，通常从主机入侵株。

这些酶不同于哺乳动物胶原酶，他们的攻击很多网站沿耳轮（赛夫特和哈珀1971年）的。

从溶组织梭菌胶原酶，曼德尔等人准备。

（1953），已被研究最彻底的。

威尔顿和老虎伍兹（1975年和1973年）和Keil等。

（1975）报告胶原酶从无色iophagus的，：

卡里克伯克（1975）和Schoellmann和Fisher（1966）铜绿假单胞菌和默克尔等从。

（1975）从海洋细菌胶原酶。

特别令人感兴趣的是胶原酶活性和类风湿关节炎的病理之间的关系。

有人曾建议通常抑制胶原酶的关节结构，从而导致特征的关节组织破坏时，可能会被激活。

（安倍晋三和永井1973年，克鲁兹和1972年Wojtecka;Bauer等1971年，埃文森等1968）。

类风湿滑膜液中含有一种活性物质（哈里斯和1974年克兰）骨关节炎患者关节液中没有发现。

Harris等人。

（1969）报告说，类风湿关节炎患者的胶原酶抑制能力缩减一半。

他们还报告两个滑膜胶原酶。

伍利等。

（1975A和b），Harris和McCroskery，（1974）和列伊博维奇和Weiss（1971）。

胶原酶还伴有浸润性肿瘤的兔子。

（Harris等1972;McCroskery等。

1975年和1973年）。

胶原酶已得到广泛应用，在特定的细胞类型，随之而来的结缔组织（1969年河野洋平1964年派克）的隔离。

例如，在胰岛细胞移植的实验，以减轻糖尿病症状（巴克1975）有很大的兴趣。

另请参阅尤尔特等。

（1975），Shibato等。

（1975），盖茨等人。

（1972），艾希克罗等。

（1971）和拉齐和Kostianovsky（1967）。

从大鼠肝组织中的完整无缺的实质细胞也被隔离。

（1973年和1972年SeglenBerry和朋友1969年，霍华德等人1967年）。

kitabchi等。

（1971）离体大鼠肾上腺细胞和捷克和费恩（1971）的脂肪细胞。

DeOca和马利宁报告（1975）从人类肾脏和Trusler的（1975）原代细胞培养在人类染色体G显带技术。

另请参阅Benya等。

（1973年），许多额外的引用。

特别是酶活性的粗制胶原酶与其中的细胞，得到的组织（或细胞放在与用途），以及作为结果的相关性已经建立了多个正式类型。

类型1

含检测活动（胶原酶，caseinase，梭菌，和胰蛋白酶活动）的平均金额。

所以一般建议脂肪，肾上腺，肝细胞。

2型

含更大的梭菌活动。

它通常用于心脏，骨骼，肌肉，甲状腺，软骨，和肝细胞。

类型3

含低蛋白水解活性。

它通常是用于乳腺和胎儿细胞。

第4类

含胰蛋白酶活性低。

这是常用的小岛和其他应用中，诚信是至关重要的受体。

粗制胶原酶的活性谱广，它特别适用作为清创剂。

这种临床应用强调了在曼德尔研讨会报告（1972）。

另请参阅豪斯等人。

（1959）和HamitUpjohn公司（1960年）。

萨斯曼（1968）已表示其可能值椎间盘突出的治疗。

他发现，椎间隙注入一个选择性溶解髓核和纤维软骨组织的影响。

从CL胶原酶的特性。

histolyticum：

原油制剂不仅包含几个胶原酶也是一个sulhydryl的蛋白酶，梭菌（1968年米切尔），胰蛋白酶样酶（Peterkofsky和1971年Dregelmann的麻雀和1973年麦奎德）和氨基肽酶（Kessler和1973年亚龙）。

Sugasawara和哈珀（1984）和邦德和Van的疣（1984）报告净化胶原酶的Cl。

histolyticum。

分子量：

哈珀R，等。

（1965），分离出两部分，A和B，分子量分别为105,000和57,400。

组成：

曼德尔等。

（1964）报告了两种截然不同的胶原酶：

一个非常活跃的天然胶原合成的底物，但可以忽略不计的活性明胶和azocoll，第二活性明胶，但在合成基底上较不活跃。

Schaub和蟾蜍（1968）也纯化两个胶原酶：

梭状芽胞杆菌A和胶原酶2，吉田和野田（1965年）;胶原酶I和II。

哈珀和康（1970）和米切尔（1968b）也报告两个胶原酶。

河野（1968）描述了三个部分：

AA和Ba和Bb。

据推测，这种酶的亚基组成的四聚体约105,000兆瓦和57,000二聚体。

锌或钴存在下，在分子中也表示。

（Harper等人，1965;高桥和赛夫特1970）。

曼德尔等人已报告了氨基酸组成。

（1964），Harper等人。

（1965）和吉田和Noda（1965）。

的酶不含有半胱氨酸，还是蛋氨酸（高桥和赛夫特1970）的。

OptinumpH值：

7-9AA酶（河野Ø1968年）。

活化剂：

钙离子是必需的。

（高桥和赛夫特的，1970）。

抑制剂：

金属螯合剂如半胱氨酸，乙二胺四乙酸或邻菲咯啉，但不DFP中。

它也抑制，2-巨球蛋白-一个大的血浆糖蛋白（Werb等，1974）。

永濑等。

（1983）和（1983）斯特里克林Welgus的天然胶原酶抑制剂的报告。

人体皮肤酶抑制人血清（艾森等，1970），但粒细胞胶原酶（拉撒路等人1968年生）。

人类血清中含有2-巨球蛋白和1-抗胰蛋白酶，可以抑制目标胶原酶以及伍利等人所报道的第三抑制剂。

（1975）。

也已表明，胶原酶A是光灭活的存在下亚甲基蓝（高桥和赛夫特的，1970）也参看Karakiulakis等人，1991。

特异性：

梭菌胶原酶I或梭状芽胞杆菌甲降解在原生胶原蛋白的螺旋区域，优先在Y-甘氨酸键序列的-Y-的Gly-Pro的其中Y是最频繁的中性氨基酸。

这种债券合成肽基板也可以分割。

另见SOBERANOSchoellmann（1972a）和哈里斯和法雷尔（1972）。

三个河野酶的特异性研究“（河野Ø1968）。

应用

对于胶原蛋白的结构和生物合成研究的研究人员通常使用高度纯化的胶原酶制剂无其他蛋白水解活性。

à梭状芽胞杆菌（MP产品编号194124），也被称为胶原酶1，是一种高度纯化的酶基本上是免费的，梭菌胶原酶2，和其他蛋白酶。

对于组织解离大多数研究人员可使用任一种粗制胶原酶制剂或与其他酶，如胰蛋白酶，弹性蛋白酶，和/或木瓜蛋白酶相结合的色谱法纯化的胶原酶。

典型的含量

已报告了Gisslow和McBride（1975），罗伯逊等人利用标记的胶原蛋白的含量方法。

（1972）和Sakamoto等人。

（1972）。

由于真正的胶原酶攻击分子的螺旋区的光学旋转色散的变化反映了胶原降解（KEIL等1975）。

方法：

采用修改的程序曼德尔等。

（1953）。

与天然胶原胶原酶孵育5小时。

胶原蛋白分解的程度，使用的Moore和Stein（1948）比色法茚三酮法确定。

氨基酸解放表示为微摩尔每毫克亮氨酸胶原酶。

一个单位等于1微摩尔的L-亮氨酸的胶原蛋白在特定条件下在5小时内于37℃和pH值为7.5的等值。

试剂

•0.05中号TES[三（羟甲基）-甲基-2-氨基乙烷磺酸]，0.362mM氯化钙的缓冲液，pH7.5的

•4％茚三酮，甲基溶纤剂

0.2M的柠檬酸钠0.71mM的氯化亚锡，pH值5.0的

茚三酮柠檬酸混合物：

准备通过混合50毫升的4％的水合茚三酮在甲基溶纤剂，用50ml的0.2M柠檬酸与0.71mM的氯化亚锡，pH为5.0。

允许混合物搅拌5分钟。

•50％正丙醇

基材：

牛跟腱胶原蛋白和维生素不含酪蛋白

•50％（W/V）三氯乙酸

酶

溶解酶的浓度为1毫克/毫升的0.05M的附加费收费0.362mM氯化钙，pH值7.5。

稀释运行的1/10和1/20的上述缓冲液中。

程序

到每个四支试管中称取25毫克的牛胶原。

包括至少两个管作为空白，不包含酶。

管加入5.0毫升0.05M的TES缓冲液，并在37℃孵育15分钟。

酶稀释液0.1毫升，加入到适当的管，开始反应。

5小时后，停止通过将0.2毫升溶液中（留下的胶原蛋白），茚三酮柠檬酸混合物含有1.0毫升试管中的胶原酶反应。

中包括的酶的空白（胶原蛋白与0.1毫升TES缓冲液代替酶温育）。

在沸水浴中进行20分钟的热。

冷却后，用5毫升50％正丙醇稀释。

静置15分钟，并在600nm处读取吸光度。

从L-亮氨酸标准曲线确定微摩尔氨基酸相当于，亮氨酸解放。

非特异性蛋白酶的活动（即caseinase活动）使用上述试验和25毫克维生素免费酪蛋白代胶原确定。

5小时后，通过加入0.5ml的50％三氯乙酸停止反应。

离心后，将0.2ml的上清液转移到1.0毫升的水合茚三酮，如上处理。

Caseinase计算活动胶原酶活性。

计算

单位/毫克=（微摩尔L-亮氨酸等值解放）/（毫克酶消化混合物）

梭状芽胞杆菌A的含量测定

I型胶原酶-氯。

histolyticum

方法：

该法是基于酶特异性的坦克临-亮氨酸-甘氨酸--Arg基板的亮氨酸和甘氨酸（Wünch和海德里希，1963）之间的分裂。

这将导致在一个彩色的亲脂性片段与非着色的三肽。

在该片段的吸光度在320nm处的每单位时间的变化是酶的活性的量度。

试剂

•0.1米的Tris盐酸，pH值7.1

•0.1M氯化钙

•25毫米，pH值3.5柠檬酸

•乙酸乙酯

无水硫酸钠干燥

•基材：

PZ-PRO-LEU-GLY-PRO-精氨酸（分子量为812.93）。

溶解至5毫克/毫升的甲醇溶液。

稀释至1mg/ml时，用Tris缓冲液中。

•标准：

PZ-PRO-列伊（分子量为466.54）。

溶解至5毫克/毫升的甲醇溶液。

稀释至1mg/ml时，用Tris缓冲液中。

酶

储备液：

溶解在1毫克/毫升试剂级水。

股票1:

20和1:

50稀释用于分析。

程序

微克的标准

050100200400600800

标准0毫升0.05毫升0.1毫升0.2毫升0.4毫升0.6毫升0.8毫升

Tris缓冲液1.1毫升1.05毫升1.0毫升0.9毫升0.7毫升0.5毫升0.3毫升

氯化钙0.2毫升0.2毫升0.2毫升0.2毫升0.2毫升0.2毫升0.2毫升

充分混匀，并转让0.5毫升含有1毫升柠檬酸和5ml乙酸乙酯的标记的试管中。

15秒的涡流。

在室温下单独的所有阶段。

将有机相转移到含有350毫克钠干燥的试管中。

轻轻摇晃，让干燥乙酸乙酯。

阅读乙酸乙酯与空气干燥的空客A320。

确定净A320（测试-空白）和情节A320纳米/UG标准曲线的斜率。

确定校准系数如下：

系数=

（1）/（A320纳米/UG所述466微克/微摩尔）

酶活性检测：

吸取0.2毫升氯化钙和1.0ml的底物转化的一系列编号的试管中。

孵育在25℃的水浴中，以达到温度平衡。

在一定的时间间隔，增加0.1毫升酶的稀释各自管。

包括2个管0.1毫升水为空白。

完全相同孵育15分钟，在25°C的条件下，在一定的时间间隔提取0.5毫升，并转移到含有1毫升柠檬酸和5ml乙酸乙酯的试管中。

继续与标准曲线，阅读，干燥乙酸乙酯与空气的空客A320。

确定净A320飞机。

计算

单位/毫克=（净架A320×稀释X因子）/（0.1X15Xmg/ml的股票）

可用性：

目录编号说明尺寸可供选择

194124梭状芽胞杆菌溶组织梭菌。

活动约5万辆/干重。

提供冻干粉末测试BAEE活动和酪蛋白消化。

10U

362001从溶组织梭菌胶原酶。

活动曼德尔约300单位/毫克。

此混合物适合用于溶解结缔组织和嵌入式细胞暴露不破坏细胞膜和其他结构的情况下，由于非特异的蛋白酶的含量是非常低的。

病原菌孢子的纯度高，完全没有这种酶，细胞研究和细胞培养应用最适合。

300KU

100501从溶组织梭菌胶原酶。

无菌的，无盐，冻干。

活动约125-250单位/毫克干重。

50毫克

150705从溶组织梭菌胶原酶。

细胞培养试剂。

1克

5×1克

151459从溶组织梭菌胶原酶，高度纯化的，没有检测到非特异性蛋白酶。

活动2,000-3,000个单位重组时，每毫升1毫升缓冲。

1瓶

150704从溶组织梭菌胶原酶。

类型3，活动约3500U/克;梭菌，胰蛋白酶和caseinase>100U/克（酪蛋白福林法，pH值7.0）1克

5×1克

195109胶原酶溶组织梭菌，I级，无盐，冻干。

活动约125-220单位每毫克固体。

25毫克

100毫克

500毫克

1克

100502从溶组织梭菌胶原酶，Ⅱ级，冻干粉。

活动约125-250单位/毫克干重25毫克

100毫克

500毫克

1克

195110胶原酶溶组织梭菌，第4类，无盐，冻干。

活动约125个单位，每毫克的固体。

肝细胞的隔离级，包含梭菌，中性蛋白酶和胰蛋白酶活动。

25毫克

100毫克

500毫克

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