双向疑难解答.docx

双向疑难解答.docx

《双向疑难解答.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双向疑难解答.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

双向疑难解答

1、IEF问题

等点聚焦之后在酸端有3-4厘米呈乳白色，其他地方是透明的。

有没有人遇到这种现象啊，是什么原因啊？

最后是如何解决的？

求高手解答啊

等点聚焦之后胶条的厚度不是很均一，有一块比其他地方厚，不知道是什么原因。

泡胶没出问题，泡完之后厚度均一，就是等点聚焦之后有的地方厚，不知道什么原因，求高手解答，谢谢

回复

你的问题和我的一样，我也出现过，只要出现这样的情况，一般第2向出来结果在酸性端有横向脱尾。

用硫脲的时候会发白，但是平衡后基本消失，在我的实验中对后期结果没有影响。

胶条等电聚焦后，整根胶条是不平整的，可以看到许多隆起，在电极附近的胶条部分很厚是聚焦时离子在电极附近聚集然后胶条膨胀造成的，影响不大，注意平衡时不要弄掉

用硫脲的时候会发白，但是平衡后基本消失，在我的实验中对后期结果没有影响。

胶条等电聚焦后，整根胶条是不平整的，可以看到许多隆起，在电极附近的胶条部分很厚是聚焦时离子在电极附近聚集然后胶条膨胀造成的，影响不大，注意平衡时不要弄掉

2、2D谱疑难解析

这是网上列举的部分实例，有些是很有参考价值的，有些值得商榷，欢迎讨论[很想知道都那些专家得出的建议，以便特邀讨论。

这个是"标准2D谱"

---以下是参考谱和参考分析—

氨基甲酰化（Carbamylationtrains）导致太多蛋白斑点串，不属于常规的磷酸化等修饰

可能原因：

尿素（urea）不纯

建议：

用更纯的尿素，避免样品加热，或者用AmberliteIRN-150L去异氰酸盐（isocyanate）

蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失

可能原因：

样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀，导致TCA残留

建议：

用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA

不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱

右边的垂直条带包含了所有pIs值>pH7的蛋白。

可能原因：

？

？

建议：

？

？

？

？

样品含高丰度蛋白导致出现水平条带

可能原因：

高丰度蛋白聚集后，若采用胶面朝下的胶条槽，易造成水平条带。

建议：

采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。

出现水平条带（窄pH范围胶条）

可能原因：

聚焦不够，或者盐离子过多

造成水平条带的其它原因：

Detergent去污剂浓度过低；

尿素浓度过低；

DTT浓度过低，或者用量过少；

上样位置不合适（比如cuploading）；

蛋白酶活性；

胶条溶胀时间过短；

样品中含有不溶的蛋白（centrifuge1hr/40,000g）；

空气中的CO2

试剂不新鲜

可能原因：

TEMED不新鲜。

建议：

尽管TEMED用量很少，还是建议每年更换一瓶TEMED。

试剂质量影响蛋白斑点成像

可能原因：

Tris质量不好

步骤错误导致蛋白丢失

可能原因：

蛋白转移电压过高（400V，18cm胶）——在开始的45分钟内不要超过2W/gel（Ettansize）

植物样品

可能原因：

多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色

建议：

样品用clean-up处理

蛋白斑点出现垂直条带

可能原因：

平衡过程中DTT不足，导致一些蛋白出现垂直条带。

样品中含盐等离子过高

可能原因：

样品中含盐等离子杂质过高，导致等电聚焦失败。

建议：

避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mMTris洗细胞。

pH6－11的胶条

RehydrationLoadingCuploading

建议：

对于碱性pH范围胶条，用杯上样效果更好

保存第二向凝胶时温度太低

可能原因：

保存第二向凝胶时温度太低，SDS有沉淀

建议：

长时间保存（2days-2weeks）在4－8℃，在二向进行前应提前把凝胶取出，室温放置。

3、求助！

！

！

关于IEF

好奇怪一样的样品和一样的试剂上周IEF电流正常电压能上去

我重新配了一个1MDTT重新跑就电压死也上不去了到了8000就不行了（胶条是18cm的）一直掉到3000DTT确实没配错

求各位赐教！

回复

1M的DTT，太大了吧，一般是20－100mMDTT.

不是啊是配成这个母液然后加在水化液里面

蛋白提取时，TCA和丙酮的作用是什么？

用三氯乙酸和丙酮提取蛋白时，TCA和丙酮的作用分别是什么？

TCA：

①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐；

    ②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀；

    ③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大。

丙酮：

抽提TCA

老生谈电泳-等电聚焦

介绍：

蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带不同的电荷或者不带电荷，对于每一个蛋白质而言都有一个特定的pH，此时蛋白质的净电荷为零，其在电场中不发生移动，此时环境中的PH即为该蛋白的等电点（pI）,等电点通常在pH3-12之间（大多数在4-7之间），所以目前常用的两个pH胶条范围是3-10（IPG胶条的材料一般只能达到这么大的范围）或者4-7。

IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3-10不同值的缓冲体系。

根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。

通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。

我个人认为等电聚焦是蛋白质电泳中最关键的一个步骤，聚焦效果的好坏直接影响到后面的分离和分析，聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。

过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失，但是这种条纹比较细，和聚焦不完全产生的条纹还是有所区别的。

最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。

试剂与配方：

水化液配方与蛋白溶解液配方一致。

实验操作（以鞍马西亚（GE）IPGhor为标准）：

　样品体积及上样量

染色方法    上样量（ug）   胶条长度    PH范围    体积

银染    50    11cm    3-10    200ul

    100    24cm    3-10    450ul

考染    300    11cm    3-10    200ul

    600    24cm    3-10    450ul

银染    70    11cm    4-7    200ul

    150    24cm    4-7    450ul

考染    400    11cm    4-7    200ul

    1000    24cm    4-7    450ul

1，从-20度冰箱取出样品蛋白和水化液，在室温下平衡10分钟，使融化。

2，按以上标准将样品液和水化液混合均匀，将溶液15000g离心10分钟。

3，从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟（放置时间太长会吸湿空气中的水分，使水化膨胀不完全）。

4，取出聚焦槽，沿着槽的尖端中央连贯加入样品（正极）。

在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

5，当所有的蛋白质样品都已经加入到槽中后，用镊子轻轻的从酸性端（正极尖端）去除预制IPG胶条上的保护层。

6，分清胶条的正负极胶面朝下，先将IPG胶条尖端（阳性端）朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端（阴极），使水化液浸湿整个胶条，样品液均匀分开，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。

注意：

不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。

7，在每根胶条塑料支持膜上加覆盖油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

需沿着胶条缓慢的加入覆盖油，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

8，盖上盖子并将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触。

9，设置等电聚焦程序（24cm,PH=4-7,考染）。

    温度    20°C（温度太低，尿素会结晶）

    最大电流    50uA/IPGstrip

S1    50V    12hours（水化）

S2    500V    1hour

S3    1000V    1hour

S4    1000-8000V    1hour（Gradient）

S5    8000V    10hours

S6    500V    10小时（维持）

10，中间聚焦过程中注意观察电极板上空气水分的凝结，并及时清除，低温低湿环境可以有效防止水气凝结。

聚焦结束的胶条最好立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，如果暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-20°C保存几个月。

11，胶条槽电泳结束后先用镊子夹住脱脂棉蘸取温和的洗涤剂或清洗液清洗，充分去除残余的蛋白质和覆盖油以及其它污渍（也可用牙刷刷洗电泳槽内空间），然后用蒸馏水冲洗，充分晾干后放入盒中（多余的水分会产生条纹），同时用脱脂棉蘸取清洗液清洗铜电极板。

温度为95度的1%浓度的SDS可以用来清洗干燥遗留下来的很难清洗的蛋白，加上1%的DTT可以完全除去残留蛋白，然后再用清水清洗。

操作的时候要戴手套避免污染。

如果将胶条槽首先浸泡在2-5%的EttanCleaningSolution的水溶液中过夜，然后再清洗，效果会更好。

过度聚焦会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性——想问问2Dproteome，您说如果上样量非常小，而且等电聚焦时间过长，胶条内的蛋白质（如结构、理化性质等）会不会发生变化进而影响蛋白图谱？

图谱是不是变为我上次发的那个帖子（诡异的蛋白图谱），因为这次我每一步都盯着同学做，一根上样量很小，一根我让他加大量，结果上样量小的图和上次一样差，上样量大的到还能看

实在不好意思，这几天一直忙于其它的事情，pangdou的短信前两天就看见了，但一直没有时间回答，今天抽空简单说两句，依我个人的经验，时间过长的话对图谱的影响最主要的是产生横条纹，而这种横条纹会很细很长，影响周围蛋白质的观察，至于其它方面的问题，现在还不太清楚，希望能解答你的疑惑，

一、以植物的线粒体蛋白样品做的7厘米PH4-7的胶条，上样300ug，

但背景很脏，分析一下原因

第一个问题样品需要纯化，改进你的蛋白提取方法或者使用纯化试剂盒

然后是IEF有问题，碱性端聚焦不够，增加DTT的量试试

最后二向纵纹严重，凝胶和缓冲液可能有问题

考染脱色确实不完全，而且图片可以处理一下，都看不清

二、在做双向电泳中,怎样确定你要用非线性的,还是线性的IPG胶条呢?

线性IPG胶条用于计算蛋白质点的pI,与非线性IPG胶条分离蛋白质点

无论宽pH范围还是窄pH范围都有线性和非线性胶条，线性胶条与非线性胶条的采用主要视实验材料而定。

例如，大部分植物材料蛋白的pH值跨度在4-7，可以采用pH4-7的线性胶条，pH4-7范围内的蛋白均匀分布于IPG胶条上。

如果觉得其他pH范围虽然蛋白很少，但可能有你感兴趣的蛋白，那么也可以采用pH3-10的非线性胶条，这样胶条的大部分区域分配给pH4-7，而将两端小部分分配给pH3-4和pH7-10.这样既可以保证较好的分离效果，又可以不遗漏感兴趣的蛋白。

三、二项电泳求助（见附图）

如附图所见，在跑完二向以后，有许多纵向条带，请哪位高手指教一下。

可能是聚焦不够，延长聚焦时间试试看。

IEF起始时加以低电压，然后逐渐升高电压。

另外上样之前过滤一下样品。

我的样品在上样之前是用试剂盒纯化的，然后用buffer溶解，再高速离心。

您说过滤一下是怎么过滤呢？

适当增加SDS平衡浓度，SDS-PAGE平衡延长到约20分钟，用去离子水（比如Millipore纯净水），适当降低ＤＴＴ用量。

另外，我觉得你在IEF可以适当改进，（可能是聚焦不够，延长聚焦时间试试看。

IEF起始时加以低电压，然后逐渐升高电压）。

如下一些意见供参考：

首先考虑的是样品提取，感觉样品中的杂质含量比较高，导致对等电聚焦等的严重影响，一方面可以通过用试剂盒等的方法进行去除，另外，可以通过丙酮沉淀，多次离心，缓慢升压等多种方式进行杂质去除；第二是你的胶条选择上感觉不是很好，比如胶条过短、PH范围不适宜，通过选择合适的胶条可以获得较好的结果；第三是你的SDS-PAGE凝胶电泳的时候跑的时间比较短，蛋白没有充分跑下来，全部在中上部，下次实验的时候可以增加电泳时间，同时可以适当降低SDS-PAGE的浓度，到溴芬兰前沿到底再停，效果会好一些！

关于杂质去除，一可以通过增加丙酮沉淀的次数，二可以通过对蛋白溶解液的分次离心，这样操作的效果会好很多，关于蛋白都在碱性端的问题，只能更换胶条的PH值，而且可以适当采用非线性的以代替线性的胶条，在上下分离过于集中的情况下，还可以适当更改SDS-PAGE的浓度进行蛋白点的位置调整，关于黑色和黄色，我只知道个大概，蛋白浓度过高，会反向显色，导致变白，另外，和蛋白溶液等、染色液的PH值好像也有点关系。

四、双向电泳图谱

我跑的2-D图谱有蛋白质有脱尾现象，有竖纹，那位高手帮分析一下原因？

竖纹产生的原因

1.从第一向转移到第二向时发生沉淀

2.上样量过大

3.水纯度不够，SDS-PAGE胶配制时未过滤或胶条平衡后仍带有DTT

帮忙看下这两张图

是玉米组织蛋白,大家帮忙分析一下存在的问题及改进方法,个人觉得横向有条纹,不知道什么原因?

上面的点好象有点乱,是不是蛋白降解了啊?

有些横纹，是不是上样量稍微有一点点大？

偶试验研磨时有气泡会有横纹

还有可能是聚焦不好

不错啊，不过换个ph的胶条应该会更好，有点挤。

2-D图中间很明显的竖纹，将图分成两半，碱性端聚焦不错，酸性端就是黑乎乎

各位前辈，我刚做双向电泳不久，跑的图谱都存在同一个问题，我不知道哪里出错了，大家帮帮我！

 我的样品是螺类肝脏组织，匀浆后超声，提取的总蛋白。

裂解液配方，水化液配方，及各种试剂配方都是按照GE公司操作手册上的，所有试剂也购买自GE公司。

裂解液配方：

7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，40mMDTT

采用主动水化上样：

30v，step,12h,;    500v,step,1h;      1000v,step,1h;    8000vgradient  0:

30h,    8000v，step  50000vhr,  聚焦正常，电压能上升至8000v，电流为30uA左右；平衡：

100mgDTT/10ml  平衡液,15min;  250mgIAA/10ml平衡液  15min

SDS-PAGE:

10mA/胶1小时，再20mA/胶跑至底;

采用EMBL银染法.

    每次出来的结果都是这样，在胶中间好像明显有一条竖纹将胶分成两半，酸性端点又少，有横纹和竖纹，黑乎乎的，而碱性端算是正常的。

  下面的几张图胶条是PH4-7,marker上在酸性端，请告诉我问题出在哪里啊？

PH4-7,

再来两张，都是PH4-7的胶条，marker上在酸性端，胶条没有过期，Buffer也是加得IPGBuffer4-7的

这种现象我以前也遇到过，原因可能是你的蛋白提取溶液里面有硫脲，不知道我说的对不对！

如果用了的话，你下次提取的时候把硫脲去掉，可能效果会好一点！

祝实验顺利！

看了你的方法，真有硫脲，呵呵！

那应该就是这个原因了

我的问题已经解决了，去掉硫脲确实效果要好些，不过我后来不用丙酮沉淀了，用CLEAN-UP试剂盒处理，呵呵，恼人的横纹和竖纹就都消失了!

2-D时水平方向出现拖尾现象，求原因

2-D时水平方向出现拖尾现象，请问是什么原因造成的？

请大侠指点

横纹

横纹产生原因

1.聚焦时间太短，高分子量蛋白未聚焦到等电点。

2聚焦时间过长，蛋白质降解

3.尿素浓度太低

4.IPG胶条水化时间短，未泡涨至原始厚度

5.裂解液或水化液DTT不够

6.单个蛋白质得多重氧化

7.由于DTT朝阳极移动，碱性端DTT消耗

8.样品内源性水解造成的假象

9.角蛋白污染或巯基乙醇造成

10.蛋白水化加样时产生沉淀

11.蛋白抽提时有不溶物在样品中

一般来说是除盐性不好

失误分析

胶貌似凝得不均匀哦或者配胶的时候漏了吧胶面不平感觉是这样啊不知道说的对不对跑的时候有重影和拖尾呢电压有可能有点大

如上面提到的可能是不完全聚合引起的不规则聚合，可能是温度或Ap和TEMED的过量引起的过快聚合。

或是灌胶时漏胶吧！

另外可能IPG胶条的结合不好，有气泡

聚焦失败双向失败影响因素很多，我觉得这次可能是没有完成聚焦造成的。

好像有点重影啊？

书上说是胶条摆放不正确，可以试一下哦！

首先是排除法，根据你的图片来看，蛋白提取是没有什么问题的，但是从图片上看横向虽然没有拖尾，但比较模糊，等点聚焦时间应该是够了，但我猜测是不是因为聚焦完了没有及时进行第二向电泳导致聚焦好的蛋白扩散？

第二个问题是楼上已经说的重影，原因是胶条摆放到第二向胶的上方的时候摆放不正确导致胶条的胶面与玻璃板接触了，注意操作一下就可以解决了。

求助！

帮忙看一下图，分析原因！

样品种可能有干扰IEF的离子存在，制备时对样品加以透析试试看，也可以稀释样品试试看看，或者上样前对样品用丙酮或TCA沉淀。

是一向的问题，可能平衡时间不足

产生横条纹的原因很多，例如你的水化液中DTT的量是否加的足够。

碱性端横条纹

如果右边是碱性端，那很可能是DTT不足，DTT本身带负电，在第一向等电聚焦时会向正极迁移，碱性端蛋白的二硫键会重新连接，蛋白之间形成聚合体，导致横纹产生。

为什么总有横纹

电压升上去了，电流一直是41，好像没降下来，为什么总有横纹呢，我的样品是细菌，请教高手

横纹产生原因

1.聚焦时间太短，高分子量蛋白未聚焦到等电点。

2聚焦时间过长，蛋白质降解

3.尿素浓度太低

4.IPG胶条水化时间短，未泡涨至原始厚度

5.裂解液或水化液DTT不够

6.单个蛋白质得多重氧化

7.由于DTT朝阳极移动，碱性端DTT消耗

8.样品内源性水解造成的假象

9.角蛋白污染或巯基乙醇造成

10.蛋白水化加样时产生沉淀

11.蛋白抽提时有不溶物在样品中

在做双向电泳中有关提取蛋白的问题

大家好：

１、请问一下，在双向电泳提取蛋白质时，我的实验材料是昆虫（跟蚊子差不多），可不可以直接用裂解液提取？

裂解液的成分是以前做western时提取蛋白质的配方。

２、还有一个问题是我看到好多是用ｔｃａ－丙酮提取的，然后加裂解液，这种方法与直接用裂解液提取有什么区别吗？

３、看到说如果蛋白质样品中如果盐离子过高的话，等电聚焦时电压上不去，那应该怎么做？

怎样去除盐？

问题1

不可以啊，会有核酸等杂质的影响

问题3

用纯水透析可以除盐

问题1：

最好不要

问题2：

通过TCA丙酮的沉淀可以除去一些杂质，使获得的蛋白更纯，

问题3：

盐离子过高可以通过梯度缓慢升压来充分除盐。

等电聚焦问题

当跑一向的时候，电流增大，达到最大电压后，电流逐渐减小，达到1微安，这个时候等电聚焦是否完成？

溴酚蓝还没有跑到阳极端。

换了一个湿润的滤纸，结果电流上来了，电压达不到。

这是为什么？

如果蛋白质到达等电聚焦点后是不会再导电的啊，为什么加了湿润的滤纸后电流还那么高，怎么办。

到底什么才是判断等电聚焦完成的标志。

溴酚蓝还没有跑到阳极端,肯定没聚焦好。

看你描述的过程，两性电解质貌似有问题，电流不可能小到1微安。

“换了一个湿润的滤纸”，电流升高，说明滤纸不干净，使用原装盐桥纸片。

谢谢你的答复，聚焦完全电流也不可能达到1微安吗，我换了一种方法换滤纸，先把滤纸放到超纯水里浸泡几分钟，然后用镊子夹出，放到一次性手套上使劲压，再加到电极上，结果电流降下来了，达到4微安，确实电流大小除了样品纯度外，还与滤纸干净程度，湿润程度有关。

既然这样怎么知道有没有达到等电点呢？

  电泳强度一定的情况下，如果滤纸电阻大，到达胶条的电压就小，这样虽然电流很小，胶条里的蛋白质也不能到达等电点，如果增加滤纸的湿润程度，滤纸的电阻就变小，这样整个胶条的电流就增加，电流永远也降不下来。

达不到应该要的聚焦电压。

在什么情况下，我才能知道胶条两端的电压是等电聚焦电压，真的没有一个量化标准吗？

  通过增加电流使得溴酚蓝终于跑到头了，但是接下来，我怎么知道有没有聚焦完成呢？

除了电压外，还要看什么，说真的电压太好控制了，只要把滤纸的电阻搞大（当然这样做是自欺欺人）

先说溴酚蓝，它是起指示作用，一般在前面三步除盐完成时（以17cm胶条为例在电压1000-2000v时）肯定跑到头。

这时候我认为大分子蛋白聚焦还没开始或刚刚开始，因为电压太低。

然后说电流，一般每根胶条限电流50微安，其目的是防止过热。

在IEF最开始几步除盐过程中，由于最大电流的限制电压不会升太快，保证盐离子去除充分。

如果不设这个上限，由于样品中盐离子的存在，电流过载，产热太多无法控温会影响聚焦甚至烧干胶条。

最后说电压，不同长度的胶条聚焦电压不同，11cm8000v，17cm及以上10000v。

聚焦完成没有可以看见的指标来判断（不过结束后聚焦好的胶条会有清晰的纵纹），但是聚焦程序设定是有经验可依的。

例如17cm胶条总聚焦强度到达8-10万Vh即可。