紫外可见分光光度计操作规程.docx

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紫外可见分光光度计操作规程

紫外-可见分光光度计操作规程

（TU1810）

1．目的：

制订本标准的目的是为规检验人员在质量检验过程中的操作，保证检验结果的正确性。

2．适用围：

本标准适用于二厂检验员对产品质量的检验。

3．职责：

QC检验员对本标准的实施负责。

4．程序：

4.1简述

紫外-可见分光光度法是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收来进行分析的一种仪器分析方法。

这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。

朗伯—比耳定律（Lambert—Beer）是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。

当入射光波长一定时，溶液的吸光度是吸光物质的浓度及吸收介质厚度（吸收光程）的函数。

其常用表达式为，式中为系数：

A=ε·ι·C

式中A为吸光度；

ε为吸收系数；

C为溶液浓度；

ι为光路长度。

如溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm，相应的吸光度即为吸收系数以

表示。

如溶液的浓度（C）的摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。

4.2仪器

紫外可见分光光度计是基于紫外可见分光光度法的原理工作的常规分析仪器。

根据光路设计的不同，紫外可见分光光度计可以分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。

4.2.1仪器测量条件选择

1.测量波长的选择

通常都是选择最强吸收带的最大吸收波长λmax作为测量波长，称为最大吸收原则，以获得最高的分析灵敏度。

而且在λmax附近，吸光度随波长的变化一般较小，波长的稍许偏移引起吸光度的测量偏差较小，可得到较好的测定精密度。

但在测量高浓度组分时，宁可选用灵敏度低一些的吸收峰波长（ε较小）作为测量波长，以保证校正曲线有足够的线性围。

如果λmax所处吸收峰太尖锐，则在满足分析灵敏度前提下，可选用灵敏度低一些的波长进行测量，以减少比耳定律的偏差。

2.适宜吸光度围的选择

任何光度计都有一定的测量误差，这是由于测量过程中光源的不稳定、读数的不准确或实验条件的偶然变动等因素造成的。

由于吸收定律中透射比T与浓度C是负对数的关系，从负对数的关系曲线可以看出，相同的透射比读数误差在不同的浓度围中，所引起的浓度相对误差不同，当浓度较大或浓度较小时，相对误差都比较大。

因此，要选择适宜的吸光度围进行测量，以降低测定结果的相对误差。

在实际工作中，可通过调节待测溶液的浓度或选用适当厚度的吸收池的方法，使测得的吸光度落在所要求的围。

3.仪器狭缝宽度的选择

狭缝的宽度会直接影响到测定的灵敏度和校准曲线的线性围。

狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，势必要提高仪器的增益，随之而来的是仪器噪声增大，于测量不利。

选择狭缝宽度的方法是：

测量吸光度随狭缝宽度的变化。

狭缝的宽度在一个围，吸光度是不变的，当狭缝宽度大到某一程度时，吸光度开始减小。

因此，在不减小吸光度时的最大狭缝宽度，即是所欲选取的合适的狭缝宽度。

4.3紫外-可见分光光度计的检定

4.3.1波长示值误差与重复性

仪器波长示值误差指标为±0.3nm，波长重复性指标为0.2nm，您可以用仪器氘灯的两条特征谱线检验，具体检验方法如下：

①确认仪器光谱宽带为“2.0nm”。

开机初始化完成后，按数字5键进入系统应用界面，在系统应用界面中按数字键2强狭缝设定为“2.0nm”。

②在系统应用界面按RETURN键返回仪器主界面，按2键选择光谱测量功能。

③按F1键选择参数设定功能，按相应数字键设定采样间隔为0.2nm、扫描速度为中速、波长围为660nm~480nm、纵坐标围0-100、测光方式Es、光源选择氘灯

④按RETURN键返回光谱扫描界面。

⑤按START/STOP键并输入增益值为6，按ENTER键确认，开始扫描。

⑥扫描结束后，按F2键并输入阈值（1~100）后，按ENTER键进行峰值检出（如果检出峰波长为0.000nm，则需要按键返回，然后重新按F2键输入比前次输入小的数值作为阈值，重新进行峰值检出）

⑦按F4键打印输出

重复扫描三次，并做峰值检出，氘灯的两个峰标准值为656.1nm和486.0nm。

4.3.2基线平直度

样品池中不放任何遮挡物，以空气为空白进行测量，用波长扫描功能测量全波段的吸光度值，其具体测量方法如下

①首先确认仪器光谱宽带为2.0nm

②在仪器主界面俺2键选择光谱测量模式

③按F1键进入参数设置界面，按相应的数字键设置测光方式Abs、采样间隔为1nm、扫描速度为中速、波长围为1100~190nm、纵坐标围为-0.01Abs~.0.01Abs

④按RETURN键，返回光谱测量主界面，按AUTOZERO键进行基线校正。

⑤按START/STOP键进行扫描

⑥按F4键打印输出。

读取曲线的吸光度值，在1090nm~200nm波长，测量扫描图谱中起始点与最大偏移之差即为仪器的基线平直度。

分光光度法允差围

波长（nm）

吸收强度

吸收系数（

）

允差围

235

最小

124.5

123.0~126.0

257

最大

144.0

142.8~146.2

313

最小

48.62

47.0~50.3

350

最大

106.6

105.5~108.5

可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英池中，在规定的波长处测定透光率，应符合下表中规定。

试剂

浓度（%，g/ml）

测定用波长（nm）

透光率（%）

碘化钠

1.00

220

<0.8

亚硝酸钠

5.00

340

<0.8

合规定。

4.4.1计算分光光度法

按《中国药典》规定，计算分光光度法一般不宜用于含量测定，对于少数采用计算分光光度法的品种，应严格按各品种项下规定的方法进行。

用本法时应注意：

有一些吸光度是在待测成分吸收曲线的上升或下降陡坡处测定，影响精度的因素较多，故应仔细操作，尽量使供试品和对照品的测定条件一致。

若该品种不用对照品，如维生素A测定，则应在测定前对仪器作仔细的校正和检定。

4.4.2比色法

供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区。

用比色法测定时，由于显色是影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。

除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。

当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。

4.5注意事项

4.5.1试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。

4.5.2使用的石英吸收池必须洁净。

当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。

4.5.3取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。

装样品溶液的体积以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。

吸收池放人样品室时应注意每次放入方向相同。

使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干，防尘保存，吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3:

1v/v）混合液稍加浸泡后，洗净备用。

如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。

4.5.4含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末瑞吸收。

因此，当作溶剂使用时，它们的围均不能小于截止使用波长。

例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。

另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。

因此，在检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定吸光度，溶剂和吸收池的吸光度应符合下表规定。

以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定

波长围（nm）

220~240

241~250

251~300

300以上

吸光度

≤0.40

≤0.20

≤0.10

≤0.05

每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的同批溶剂。

4.5.5称量应按药典规定要求。

配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。

含量测定时供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份。

吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以。

作鉴别或检查可取样品1份。

4.5.6供试品溶液的浓度，除各品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸光度以在0.3~0.7之间为宜，吸光度读数在此围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性围，配制合适的读数浓度。

4.5.7选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽的10%，否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供试品溶液的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外分光光法测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但当吸收带的半高宽小于20nm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查需用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸光度会偏低。

4.5.8测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰±2nm处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。

4.5.9用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的pH值是否一致，如pH值对吸收有影响，则应调溶液的pH值一致后再测定吸光度。

4.6结果计算

4.6.1对照品比较法可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。

C样品=A样品×C对照/A对照

式中A为吸光度值；C为测试液浓度（以mg/ml计）。

4.6.2吸收系数法规定的吸收系数，系指

，即在指定波长时，光路长度为1cm，试样浓度换算为1%（g/ml）时的吸光度值，故应先求被测样品的

值，再与规定的

值比较，可计算出供试样品的含量。

（样品）=

式中A为供试品溶液测得的吸光度值；

C为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数（g/ml）；

L为吸收池的光路长度（cm）。

供试品的含量%=

×100

式中

（样品）为根据前式计算出的供试品吸收系数；

（标准）为药典或药品标准中规定的吸收系数。

4.7吸收系数测定法

本法主要用于新品种的吸收系数测定。

4.7.1测定方法取精制样品精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度读数在0.6~0.8之间，置1cm吸收池中，在规定波长处按5.5.8项的规定测出吸光度读数，然后再用同批溶剂将溶液稀释1倍，使吸光度在0.3~0.4之间，再按上述方法测定。

样品应同时测定2份，同一台仪器测定的2份结果，对平均值的偏差应不超过±0.3%，否则应重新测定。

测定时，先按仪器正常灵敏度测试，然后再减小狭缝测定，直到减小狭缝吸光值不增加为止，取吸光度不改变的数据。

再用4台不同型号的仪器复测。

吸收系数可根据朗伯-比尔定律求算，以下例说明：

已知某化合物的分子量为287，用乙醇配成浓度为0.0030%的溶液，在波长297nm处，用1cm石英池，测得吸光度为0.6139，求

值及摩尔吸收系数ε值。

297nm=A/CL=

=205

ε297nm=A/CL=

=5874

4.8开机

开机前打开仪器样品室盖，观察确认样品室无挡光物。

开机后，仪器显示初始化工作界面，仪器将进行自检并初始化整个过程需要约2min左右，如果初始化正常结束，系统进入仪器的操作界面，如下图所示：

系统初始化…………

1.存检查：

正常

2.样品池电机复位：

正常

3.波长电机复位：

正常

4.狭缝电机复位：

正常

5.滤光片电机复位：

正常

6.光源电机复位：

正常

7.钨灯检查：

8.氘灯检查：

9.波长检查：

10.参数初始化：

系统忙……

仪器初始化完成后，您便可以开始对仪器进行操作。

仪器通常需要经过60min的预热时间使光源达到稳定，为保证测量数据的准确性，尽量不要在仪器预热时进行测量。

5.0光度测量

在此功能模块下，可测定样品在确定波长下的吸光度或透过率，完成K系数运算和测量数据打印等功能。

5.1进入光度测量模式

在仪器主界面下根据提示按1键选择光度测量方式，仪器进入光度测量模式，显示界面变为光度测量主界面，按RETURN键返回仪器主界面，如图所示：

退出光度测量时，系统在信息提示区显示“数据将丢失，继续？

（是：

ENTER，否CLE）”的信息提示您对当前已测得的数据进行操作。

测试按ENTER键，系统将返回仪器主界面，所有已测得的数据将丢失。

按CANCLE键，系统退回到光度测量主界面，提示信息变为“请按START键测量”，您可以继续光度测量的操作。

下面根据图3-2给出了光度测量主界面的具体介绍：

①此处“光度测量”表示目前为光度测量模式；“990nm”为当前的工作波长；“0.000Abs”表示目前实时测得的吸光度值。

②此部分为工作区，以表格的形式显示具体测量的数据，每屏可显示最多9个测量数据值，超过则会自动分屏显示。

③此部分为信息提示区，当前的信息提示您按START/STOP键开始测量。

④此处显示当前时间，图中显示的时间为4月15日8时34分。

⑤此部分为功能键提示区，显示F1~F4键的功能。

具体按键功能如下：

★F1—进入参数设定界面；

★F2—删除测量数据，刷新屏幕；

★F3—设置样品池状态；

★F4—打印测量结果。

另外在此画面下，按键盘的操作键GOTOWL可进行工作波长的设置；按AUTOZERO键可完成当前波长下自动校零的功能。

5.2参数设置

在光度测量主界面下，按F1键进入光度测量参数设置界面，按RETURN键返回到光度测量主界面，如图所示：

在该界面下可设置测量的光度方式，测量波长和K系数运算的系数，根据界面下方的提示按相应的数字进行各项参数的设置。

所有参数设置完成后，按RETURN键返回到光度测量主界面。

5.3设置光度方式

在光度测量模式下，仪器提供Abs（吸光度）、T%透光率和R%（反射率）两种光度方式供您选择。

在光度测量参数设置界面按1键设置光度方式，每按一次1键，Abs、T%和R%交替变换，如图所示。

5.4设置测量波长

在光度测量参数设置界面按2键可进行测量波长设置，如图所示：

设置波长界面的底部，系统提示您输入您想要设置的测量波长，用数字键0~9和“.”输入您想要设置的测量波长，如果输入错误按CANCEL键可清楚当前的输入，输入完成按ENTER键确认后，系统提示“系统忙…”，此时系统正在设定您所设置的波长，完成设定后系统退出测量波长设定，返回到光度测量参数设置界面。

您也可以在下图所示的光度测量主界面下，按GOTOWL键设置光度测量的工作波长。

在光度测量界面的底部，系统提示您输入您想要设置的测量波长，用数字键0~9和“.”输入您想要设置的测量波长，如果输入错误按CANCEL键可清楚当前的输入，输入完成按ENTER键确认后，系统提示“系统忙…”，此时系统正在设定您设置的波长，完成设定后系统退出测量波长设置界面，返回到光度测量主界面；不输入数据按RETURN键可直接退出测量波长设定界面，返回到光度测量主界面。

5.5输入K系数值

在光度测量参数设置界面按3键可进行光度测量K系数的设置，如图所示：

设置K系数界面的底部，系统提示您输入你您想要设置的K系数，用数字键0~9、“.”和“—”输入K系数，如果输入错误按CANCEL键可清除当前的输入，输入完后按ENTER键确认，系统设定完成输入的K系数后退出K系数设置界面，返回到光度测量参数设置界面。

5.6暗电流校正

进行暗电流校正可以消除仪器部分噪声，保证样品的测量结果更为准确。

一般在仪器环境发生变化时，您必须进行仪器的暗电流校正，所谓的环境变化主要是指：

环境温度变化较大时、安装位置改变、做高吸收度样品时等。

（建议您在启动仪器预热后，在进行测量前进行暗电流校正，保证数据结果的准确性）。

暗电流校正的具体操作如下：

在光度测量参数设置界面按4键进行暗电流校正，此时在提示区显示“系统忙…”

，大约10s后提示信息变为“请按数字键选择”，此时表示暗电流校正完成，如上图所示

5.7试样池设置

在试样池设置界面下，您可以选择您所配置的试样池（包括：

固定池、五联池和八联池）。

如果所配置的试样池为八联池或者五联池，，您还可以设置使用的试样池数，并进行移动试样池，试样池复位等操作。

在下图所示的光度测量主界面下，按F3键进入试样池设置界面，如果所示

在试样池设置界面下，根据提示按相应的数字键进行您所需要的设置，完成设置后，按RETURN键返回到光度测量主界面。

5.8选择试样池类型

在试样池设置界面下按1键进行试样池类型的设置。

系统提供的试样池类型有固定池架、五联池架和八联池架三个选项，每按一次1键，系统在固定池、五联池和八联池之间交替转换，如图所示。

请根据自己实际所配置的试样池类型，选择适合您的试样池类型。

5.9设定使用试样池数

此项参数仅对五联池或八联池有效。

在试样控制界面下，按2键进行使用样品池数设置，如图所示：

在试样池设置界面的底部，系统提示您输入您想要设置的使用试样池数，用数字键0~9输入使用试样池数，如果输入错误按CANCEL键可以清楚当前的输入，输入完后按ENTER键确认，系统设定完成输入的使用池数后返回到试样池参数设置界面；不输入数据按RETURN键可直接返回到试样池参数设置界面。

在测量过程中，系统根据该项设置对指定书目的试样池逐一进行测量，序号以n-1,n-2,…标识，n标识第n次测量，后面的数字表示样品池序号。

如果使用池数为1个，或者将多样池修改样池数为1，则重新回到主界面进行测量后，已测得数据按照1-1,2-1,3-1,4-1….顺序编号。

6.0一号池空白校正

此项参数用来设定是否要进行一号池空白校正（仅对五联池和八联池有效），此项设置有“否”和“是”两个选项，每按一次3键，选项在“否”和“是”之间交替切换，如图所示。

空白校正的意义是把位于1号试样池的试样作为空白，对其他试样池（除一号样品池外的其他设定的样品池）进行测定。

在测量开始时，系统将以1号样品池的试样作为空白进行校零。

6.1移动试样池

此项参数仅对五联池和八联池有效。

在试样池设置界面下，按数字键4将移动试样池架到下一试样池。

此选项后面的数值标示当前在光路上的试样池编号，每按一次4键，试样池架将向下移动一个单位，此选项后面的数值也相应的加1，直到样品池编号的最大值后，样品池复位到1号样品池，以此循环。

样品池的最大编号五联池为5，八联池为8.

6.2试样池复位

此项参数仅对五联池和八联池有效。

不管当前光路上是几号样品池，在试样池设置界面下按数字键5将试样池架复位，使得1号样品池回到光路上。

6.3单池测样

在试样池类型选择为八联池或者五联池时，当使用试样池数设置为1,1号池空白校正选项为“否”时，可用<移动试样池>功能选择八个试样池（或五个试样池）中的任一个作为测量样池，随后的测量仅对选中的样池操作。

6.4自动校零（校100%）

在光度测量设置界面下，ZERO键可对当前工作波长进行零吸光度（透过率100%）校正。

在校正前，应先放入空白样品（如：

溶解待测样品的溶剂等），然后进行校正操作。

当使用单样品池进行测量时，单样品池测量包括使用单样品池架和多样品池的单池测样，（关于多样品池的单池测样请参考<单池测样>）。

测量时首先参考<参数设置>和<试样池设置>设置好各种测量参数和试样池参数（主要是选择样品池类型和多样品的单池设置），然后参考<自动校零>进行校零操作；校零后将装好样品的比色皿放入样品池，按START/STOP键，重复测量一次样品，测量的结果将显示在界面上，如图所示。

测量结果的表格中“No.”表示测量数据的编号，图中表示第2次测量的第1号样品池的结果（如果是多样品的单池测量，编号“1”表示的是当前使用的样品池）；“Abs”表示测得样品的吸光度值；“K*Abs”表示吸光度值经过K系数运算后的值，图中测量时的K系数的值为10.

6.5当使用多样品池进行测量时

只有配置多样品池架（如：

八联池、五联池等）后才能进行多样品池测量，您可以根据实际需要选择您需要使用的样品池个数。

使用多样品池测量可以大大的提高您的工作效率。

使用多样品池测量时的测量结果如图所示，表格中“No.”表示测量数据的编号，图中“2-3”表示第2次测量的第3号样品池的结果；“Abs”表示测得样品的吸光度值；“K*Abs”表示吸光度值经过K系数运算后的值，图中测量时的K系数的值为10.图中表示的是使用3个样品池进行2次测量的结果。

测量结果查阅，如果测量结果超过了显示器显示的围（一屏最多显示9个），您可以用方向键↑↓逐行查阅测量结果。

测量结果的删除

测量结果结束后，您可以按F2键清楚测量数据，此时系统提示“数据将丢失，继续？

（是：

ＥＮＴＥＲ，否ＣＬＳ）”根据提示按ＥＮＴＥＲ键确认，系统将清除所有测量数据；按CANCEL取消删除操作，系统提示变回“请按START键测量”，您可以继续其他操作，如果所示

请您在删除测量结果前进行数据的打印输出，以避免数据丢失造成损失。

7.0光谱测量

在此功能模块下，可对样品在一段确定波长的吸光度Abs、透过率T%和样品光束（或者灯）能量Es和参比光束能量Er进行测量及打印。

7.1进入光谱扫描测量模式

在仪器主界面下根据提示按2键选择光谱测量方式，仪器进入光谱测量模式，显示界面变为光谱测量主界面，按RETURN键返回仪器主界面，如图所示：

退出光谱测量时，系统在信息提示区显示“数据将丢失，继续？

（是：

ENTER，否：

CLE）”的信息，提示您对当前已测得的数据进行操作。

此时按ENTER键，系统将返回仪器主界面，所有已测得的数据将丢失。

按CANCEL键，系统退回到光谱测量主界面，提示信息变为“请按START键测量”，您可以继续光谱测量的操作

下图给出了光谱测量主界面的具体介绍：

①此处“光谱测量”表示目前为光谱测量模式；“990nm”为当前的工作波长；“0.000Abs”表示目前实时测得的吸光度值。

②此部分为工作区，以平面坐标图的形式显示测得的谱线。

图中的横坐标为波长值，纵坐标为吸光度值Abs（根据光度方式的不同，纵坐标还可以为透过率T%和能量值Es、Er）。

③此部分为信息提示区，当前的信息提示区您按START/STOP键开始测量

④此处显示当前时间，图中显示的时间为4月15日8时34分

⑤此部分为功能键提示区，显示F1~F4键的功能。

具体按键如上图所示。

7.2参数设