条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究doc.docx
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条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究
摘要
本文优化了超声波或微波辅助同时提取条斑紫菜（尸口rP妙rayezoensis夕多糖和藻
红蛋白的工艺,采用三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合的方法去除蛋白,并用膜分离
技术对多糖进行初步分离,根据带电性质和分子量采用DEAEC一52和SePhadexG一100
纯化出三种不同的多糖组分PYPSlla!
PYPSla和PYPSZa,研究了这三种多糖的结
构,单糖组成及PYPSlla和PYPSZa这两个多糖组分的Invitro杭肿瘤活性.主要研
究结果如下:
1!
本文首次明确提出超声波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最佳提取
条件为:
超声6Omin,功率88OW,30e水浴4h,料液比1:
50,多糖提取得率为34.03%,
藻红蛋白提取得率为1.20%,藻红蛋白纯度为0.356"
2!
本文首次明确提出微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最佳提取条
件为:
微波4min,功率巧OW,30e水浴sh,料液比l:
40,多糖提取得率为16.94%,
藻红蛋白提取得率为0.417%,藻红蛋白纯度为0.255"与对照（30e水浴sh,料液比
1:
40,多糖提取得率为10.50%,藻红蛋白提取得率为0.324%,藻红蛋白纯度为0.215）
相比,超声波辅助提取多糖提取得率增加23.5%,微波辅助提取多糖提取得率增加
6.4%"
3!
本文研究得出了三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合法去除蛋白的最佳条件为:
三氯乙酸浓度2%,50e处理20min,蛋白清除率99.63%,多糖保存率90.49%,与传
统的三氛乙酸除蛋白法（三氯乙酸浓度3%放置lh,蛋白清除率为91.24%,多糖保存
率为82.84%）相比,三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合法去除蛋白效果更好,蛋白清
除率增加8.39%,多糖保存率增加7.65%"
4!
通过对超滤膜孔径的筛选,确定截留分子量分别为50kDa和3kDa的膜"采
用DE规e一52和s叩hadexe一100对50kDa和3kDa两个条斑紫菜多糖（P钾S）组分
进行纯化,得到三个单一多糖组分PYPSna!
PYPSla和PYPSZao
5!
紫外光谱分析表明PYPSlla!
PYPSla和PYPSZa不含核酸和蛋白质,是单一
组分"红外光谱解析表明PYPSlla!
PYPsla和PYPSZa呈现出多糖的特征吸收峰,
均为毗喃糖且含有硫酸基和3.6一内醚桥"气相色谱法分析表明PYPSla和PYPSZa均
由L一鼠李糖!
D一半乳糖及三种未知单糖组成,半乳糖与鼠李糖的摩尔比分别为30:
1
和12.8:
1;PYPSlla是由L一鼠李糖!
D一半乳糖及四种未知单糖组成,半乳糖与鼠李糖
的摩尔比为6.6:
L
6!
PYPSlla和PYPSZa对人肝癌细胞A549的Invitro生长均有一定程度的抑制
作用,并呈剂量依赖关系,在lm留mL时抑制率分别为43.1%和30.0%.
关键词:
条斑紫菜;多糖;提取;分离纯化;结构分析;杭肿瘤活性
EARCHONEXTRACTION,PURIFICAI,IONANDLV叮TRO
ANTITUMORACTIVITYOFP01万SACCHARIDES
FROMPOR只甘月汉
ABSTRACT
Theultrasonie一assistedormierowave一assisteds担ehronousextractionParametersof
PolysaeeharideandPhyeoeryt断nfromPorphyrayezoensiswereoPtimized.Triehloroaeetie
aeid（TCA）eombinedwiththedenaturationteirlPeratureofphycobiliproteinwasusedto
removeProteinandmembraneseParationteclmologywasusedtoisolatethe
Polysaecharides.ThreedifferentP而fiedfractionsPYPSIla!
PYPSlaandPYPSZawere
furhterobtainedbasedontheirdifferentehargeeharaeteristieandmolecularweightby
DEAEC一52andSephadexG一100ehromato9即hv,respeetivel丫Thebasies加cturesof
threemainfraetions,monosaceharideeompositionsandantltumoractivityofPYPS11aand
PYPSZainvitrowerealsoinvestigatedinthePaPer.ThePrimaryresearehresultswereas
follows:
1.hi面5PaPer,theoPtimumParametersforultrasonie一assistedsynehronousextraction
ofPolysaecharideandPhycoerythrinfromPorp冰ayezoensisweredefinitelyPresentin
firsttime.TheoPtimumeonditionwasasfollows:
ultrasoniePower880W,ultrasonietime
60min,waterextractingtemPeratUre30oCfor4hours,ratioofsolid一liquidl:
50,the
extractionPereentofPolysaecharideandPhycobiliProteinwasresPeetively34.03%and
1.2%,Phycoeryt而nPuritywas0.356.
2.InthisPaPer,theoPtimumParametersformierowave一assisteds邓ehronous
extractionofPolysaeeharideandPhycoeryt如nfromPorp冰ayezoensisweredefinitely
Presentinfirsttime.TheoPtimumeonditionwasasfollows:
microwavePower150w,
mierowavetime4min,waterextractingtemPerature30oCfor5hours,ratioofsolid一liquid
1:
40,theextraetionPercentofPolysaeeh而deandPhycobiliProteinwasresPeetively16.94%
and0.417%,Phycoery.thrinPuritywas0.255.ComParedwithcontrol（waterextraeting
temPerature30oCfor5hours,ratioofsolid一liquidl:
40,theextractionPereentof
PolysaeeharideandPhycobiliProteinwasreSPeetively10.05%and0.324%,Phycoery.t而n
Puritywas0.215）,theextraetionPereeniofPolysaeeharideofultrasoie一assistedextraetion
andmierowave一assisstedextractioninereased23.5%and6.4%,resPeetivel丫
PYPSlla和PYPSZa对人肝癌细胞A549的Invitro生长均有一定程度的抑制
作用,并呈剂量依赖关系,在lm留mL时抑制率分别为43.1%和30.0%.
关键词:
条斑紫菜;多糖;提取;分离纯化;结构分析;杭肿瘤活性
第一章文献综述
第一章文献综述
1.1海藻的研究概况
海藻（川gae或Seaweed）是海洋植物的主体,它属于低等隐花植物,主要分为
四大类:
蓝藻!
红藻!
褐藻!
绿藻,另外还包括硅藻!
甲藻!
金藻等微藻"估计全世
界海洋中生长有15000余种海藻=-]"
随着科学领域的拓展和科研技术的进步,海藻由于其独特的结构特性和生理活
性,越来越受到各国研究人员的重视"综合不同海藻及其产品的开发研究,发现海藻
的应用价值不仅体现在食用价值,还在生态环境保护!
海洋药物!
功能食品!
动物饲
料!
生物活性物质开发应用!
食品添加剂!
化工业!
有机肥料!
食品包装材料!
微生
物培养基!
化妆品以及生物能源等诸多领域和范围发挥日益重要的作用,体现出了巨
大的应用潜力和极高的经济价值"
我国是海藻资源生产加工及利用的大国,海带（LaminariojoponicaAresch）产量
名列世界首位,紫菜（Po净妙ra）产量同日本!
韩国并列为世界三大紫菜养殖国"根据
5中国海藻图谱6,我国的经济藻类有510种,其中蓝藻/种,红藻266种,褐藻115
种,绿藻103种[z]"进入21世纪以来,国家十分重视海藻资源的开发利用,将其列为
我国重点研发项目"据分析测定,海藻干物质中,粗蛋白含量多在10%~48%,高者
（如螺旋藻）蛋白质含量可达60%以上;含无氮有机化合物30%~60%,主要为海藻
胶!
淀粉!
甘露醇!
纤维素等多糖;还含有种类繁多的矿物质元素如钙!
钾!
钠!
镁!
铁等,其中碘的含量为0.4%~0.7%,是一类天然的人体补碘食品;同时海藻中还含
有vA!
vC!
vE等多种维生素,也含有多种色素和许多能促进生物生长的活性物质[3]"
研究结果表明,不少食用海藻具有防治胆结石!
便秘!
肠胃病,以及防癌抗癌,增强
人体免疫力,降低血脂,预防动脉硬化和血栓的形成,降低血糖等药用功效l4,5,6,7,8]"
目前,我国海藻加工业主要分三个层次:
初加工!
精加工和深加工"初加工主要是将
海藻干制,制成各种即食制品;精加工主要是对海藻进行脱水!
冷冻!
膨化!
调味!
切片等加工,制成相应的产品;深加工是以藻类为原料,经过充分的处理,将其中有
价值的成分加以提取应用,加工成食品,如饮料,营养品（胶囊!
口服液）等"除此
之外,海藻中的成分还可作为食品添加剂,药物,饲料等的来源"
1.2海藻多糖的研究概况
多糖印olysaccharides）又称多聚糖,是由醛糖或酮糖通过脱水形成糖昔键,并以糖
普键线性或分枝连接而成的链状聚合物"
植物多糖广泛分布于生物体中,尤其是动物细胞膜!
植物和微生物细胞壁中,是一类天然高分子多聚物,是构成生命的分子基础之一"近几十年来,人们发现多糖除
了作为生物体的能量来源,在生物合成反应以及在细胞间的识别!
受精!
胚胎形成!
神经细胞发育!
激素激活!
细胞增殖!
病毒和细菌感染!
肿瘤细胞转移等许多基本生
命过程中都发挥着重要作用[9,l"]"近年来研究发现,多糖是一种非细胞毒物质,具有
多种生物活性"如免疫调节!
抗肿瘤!
抗病毒!
抗凝血作用!
抗血糖作用!
降血脂!
抗衰老等作用功能,-l"迄今为止已经有数千种多糖得以分离纯化和完成一级结构的确
定"但是因其结构测定方法繁琐复杂,所取得的进展相当缓慢"因此,寻找新的具有
高活性的多糖仍然是多糖研究领域的一大重点"
上个世纪以前,人们对多糖的认识仅停留在淀粉领域,它一直作为食物中的能量
来源被人类所熟知"随着科学技术的发展和科研领域的扩大,越来越多的多糖种类被
人类所了解,如菌类多糖,海藻多糖等"海藻多糖（Seaweedpolysaccharid）在海藻中含
量丰富,约占干重50%以上"海藻多糖与蛋白质!
脂肪!
核酸等其它生物大分子相比,
具有更强的亲水性"这表明,海藻通过合成多糖类物质,以保持体内生命活动所需要
的自由水分,来适应海洋这个特殊的环境"同时也启迪人们,海藻中多糖承担着重要
的生理功能,是一类重要的活性物质"近年来的研究发现,海藻多糖在预防和治疗常
见病!
多发病及疑难疾病,特别是病毒性疾病!
癌症!
心脑血管病!
艾滋病中将有巨
大的应用潜能"所以,近年来海藻多糖研究成为天然产物研究的一个热点[l2]"鉴于海
藻多糖诸多的生理活性和药用价值,如何合理有效的提取!
分离!
纯化海藻多糖就成
为我们面临的重要问题"
1.2.1海藻多糖的提取!
纯化方法
海藻含有丰富的营养成分,其中蛋白质!
矿物元素含量高,脂肪含量低,是一种
质优价廉!
营养丰富的海洋绿色食品"海藻多糖一般存在于细胞内部,要提取海藻多
糖就要将细胞壁破碎,但海藻的脂肪多存在于细胞壁中,这对多糖的提取会造成一定
程度的影响,因此海藻在提取之前一般先要进行脱脂处理"从不同材料中提取海藻多
糖,一般都先用乙醇或氯仿将原料脱脂[l3>,但同时也带来了有机溶剂残留的问题"目
前,比较先进的技术是超临界二氧化碳萃取技术"该技术无毒!
处理温度低!
选择性
强!
不易燃!
溶剂可循环,无残留溶剂,适用于制药工业和食品工业,尤其适合于热
不稳定性物质[l41"目前己用于海藻脂类物体的提取研究"
多糖为大分子化合物,易溶于水,提取方法一般分为物理提取法和化学提取法"
传统的物理提取法为水提法,但耗时较长,且提取效率不高"张士国等人热水提取灰
树花子实体多糖6h,多糖提取得率5.60/0[-.,,/l"吴琼等人[l7]研究了碱溶性银耳多糖的
提取条件为提取时间3.56h,NaOH浓度0.76m0FL,液固比81.89,多糖提取得率10.72%"刘贝贝等人[18〕研究了酸提菜籽饼粕多糖的条件为提取温度100e,提取次数
小5次,提取时间（每次）1.小一sh,酸浓度0.10一"一4mo比,料液比l:
18一l:
22,菜籽
饼粕多糖得率在3.1%以上"由于多糖不耐酸碱,碱提!
酸提法会使部分多糖分解,存
在着一定的不足"谢红旗等人[l9]用酶法提取香菇多糖,中性蛋白酶用量为1.5%,酶
解温度为50,pH值为4.8,酶解时间为60min时,多糖提取得率6.3%"酶解法可提
高多糖的提取效率,并且降低蛋白质含量,但药品价格较贵,温度控制严格,操作成
本较高[20]"现在发展出一些辅助手段,如超声波!
微波辅助提取多糖法,操作简单,
且不会引入杂质,是很好的多糖提取方法"
杨永利等人[2.]利用超声波辅助提取法,通过正交试验从坛紫菜中提取多糖,最佳
提取条件为超声波功率为40OW,超声提取温度50e,料液比为1:
20,超声处理时间
45min,多糖提取得率巧.5%"在相同条件下,只用热水提取,多糖提取得率为7.5%,
实验结果表明:
超声波辅助可显著提高坛紫菜多糖的提取得率"
吴琼英等人[2z味日用微波辅助提取法,通过正交试验从条斑紫菜中提取多糖,最佳
提取工艺条件为微波功率18OW,微波提取时间smin,料液比为1:
40,在此条件下,
条斑紫菜多糖提取率为5.358%"刘四光等人[z3]利用微波辅助提取法通过正交实验法
从小球藻中提取多糖,实验结果表明,在温度70e,时间30而n,pH为7,功率为
600w条件下粗多糖的产率最高,为291.13m留g（粗多糖/干重）,远高于传统热水
浸提法所得粗多糖产率（78.52m留g,粗多糖/干重）,且所得粗多糖与热水浸提法获
得的粗多糖具有相似的红外光谱"说明在一定的实验条件下,与热水浸提法相比,微
波提取法不仅不会破坏多糖的结构,还有耗时短!
有较高的多糖产率的优势"
有研究表明,粗多糖进行脱蛋白提纯以后,其生物活性更高[24]"因此,为了提高
多糖的活性,同时为进一步研究多糖生物活性和结构之间的关系提供物质原料,一般
在多糖纯化之前先要去除多余的蛋白"目前,除蛋白的常用方法有:
Sevage法,三氯
乙酸法,酶法等[25]"多糖的进一步分离提纯可以按分子大小和形状进行分级,如分级
沉淀,利用多糖分子的体积大小和溶解度不同而分离,常用的有有机溶剂沉淀法,季
钱盐!
硫酸盐法,金属络合物法等"也可按分子所带基团的性质进行分级,如按电荷
性质分级的电泳,柱层析等"柱层析一般分为两种类型,一种是分子筛作用的凝胶柱
层析,多糖分子大小不同从而通过凝胶柱的时间不同而达到分离"如sePhadex!
sapharose!
Biogd等"另一种离子交换层析,这种分级按电荷性质不同而达到分离效
果,如带负电荷的多糖可在阴离子型DEAE一纤维素柱上用不同浓度和种类的缓冲溶液
或酸碱液洗脱得以分级"此外,还有高压液相层析!
亲和层析等[26]"
吕燕等人[2vl对广东产坛紫菜沸水提取多糖采用sevag法脱蛋白,冻千后得粗多糖"
在粗多糖溶液中加入CTAB（（十六烷基三甲基嗅化钱）以沉淀除去酸性多糖PPI,超滤以纯化中性多糖ppZ,ppZ经DE妞一纤维素!
sephadexo一200进一步纯化,得单一
组分"薛志欣等人128]将龙须菜的热水提取物,经DEAE一22和s叩hadexG一200柱层析
纯化,得到一种含微量硫酸基的琼胶多糖,此多糖经Q一SePharose柱层析鉴定为单一
组分"马丽等人[29〕将用酶解+sevage法脱蛋白提取得到的螺旋藻粗多糖ESPS和用三
氯乙酸汀CA）法脱蛋白提取得到的螺旋藻粗多糖TSPS,用DE一纤维素离子交换柱和
S叩hadexG-100柱分离纯化得精制多糖ESpSI!
ESpSZ!
ESpS3和TSpsl!
TSpSZ"
超滤法是一种用于分子分离的膜分离法,操作条件温和,.不需添加化学试剂,不
损坏热敏药物"根据待分离物质不同选择不同规格的超滤膜,膜的孔径以分子量为单
位,常用的如醋酸纤维素膜,聚矾酞胺膜"自20世纪50年代以来,膜分离技术被广
泛应用到生物大分子以及活性物质的分离纯化上来,尤其是超滤技术"超滤膜技术已
广泛应用于各类多糖的分离!
浓缩!
纯化等研究中,包括中药药源多糖!
海洋活性多
糖!
发酵多糖!
食用植物多糖等[30]"
李亚娜等[3.}将超滤技术应用于羊栖菜粗多糖浸提液的浓缩纯化,结果表明,灰分
脱除率达到92.3%,蛋白质的脱除率达到79.85%,脱盐率大于98.9%,脱色率达到91%,
多糖的截留率为90.%%,多糖制品的纯度达到86.4%"采用膜分离技术,利用其分离!
浓缩作用,大大提高了产品得率,操作简单,能耗少,工序简捷,提取率高,产品多
糖含量高"肖美添等人[32]将紫菜提取液经DEAE柱层析分离得到的酸性多糖先经透析
去除离子和小分子多糖,再用截留相对分子质量为30000的超滤膜分离得不同相对分
子质量范围的多糖组分"郑军等[33]将从海带中提取出的水溶性提取物,经截留相对分
子质量为100000的超滤膜浓缩除盐,再经凝胶柱层析分级得2个具有明显抗凝血作
用的组分"采用超滤膜技术处理多糖具有收率高!
不易破坏多糖的生物活性!
能耗低
等特点,适于工业化生产"
海藻多糖是一类组成相当复杂的生物大分子,纯化起来相当困难"采用普通的分
子筛只能进行初步的纯化,这样也只能得到分子量相近的海藻多糖混合物,它的纯度
不能用通常小分子化合物的纯度来衡量,通常提到的多糖纯品实质上只能是一定分子
量范围的均一组分"不过通过分子筛或者阴离子交换柱等可以达到多糖与蛋白分离的
目的"想要获得纯度更高的多糖纯品,就需要通过高效液相色谱!
气相色谱!
毛细管
电泳等方法来实现"
1.2.2海藻多糖生物活性研究进展
1.2.2.1抗肿瘤作用
多糖类抗肿瘤作用的主要机理之一是提高机体免疫功能,同时也与其影响细胞生
化代谢!
抑制肿瘤细胞周期和抑制肿瘤组织中超氧化物歧化酶活力有关"褐藻中的主要抗肿瘤成分为岩藻多糖（fucoidan）"Itoh及Zhuang对广泛分布于中
国海洋的鼠尾藻（Sargassumthumbergii）中主要多糖成分之一的岩藻多糖作了深入研
究,组分Gp/-A!
GIV-B明显延长了移入艾氏腹水癌细胞的IC侧Sl"小鼠的生存时间,
分别为对照组的349%和215%"8只注射GIV-B溶液的小鼠中有1只治愈"而注射
GIV-A溶液的8只小鼠中有5只治愈"他们认为岩藻多糖的抗肿瘤活性与其加强免疫
应答有关[34,351"王庭欣等发现,海带和裙带菜等褐藻类中含有一种能诱导癌细胞-"自
杀,,的物质"将从海带等褐藻中提取的高纯度岩藻多糖类物质注入人工培养的骨髓性
白血病细胞和胃癌细胞后,其细胞内的染色体就会被自身酶分解,而正常细胞不受伤
害[36]"季宇斌等指出,海藻多糖对5180及H22肿瘤有明显的抑制作用[37]"刘晓梅等
人的研究表明,螺旋藻多糖抗肿瘤作用的同时则明显促进CFU一GM增殖!
减轻化疗
引起的骨髓细胞凋亡[38]"
1.2.2.2抗病毒作用
自1958年Githe:
等发现Gelidulncanilagenium提取出的多糖和卡拉胶具有抗流感
B和抗腮腺炎病毒后,科学家逐渐发现海藻多糖对多种病毒有抗性"
红藻多糖对牛免疫病毒仍W）的复制有明显的抑制作用,其抑制率与抗爱滋病
（A田S）病毒药物叠脱氧胸腺嗜淀近似,因而红藻多糖作为抗A刀DS药物是可行的[39l"
从红藻Gigarti""skottsbe馆11中分离出一种环化的卡拉胶1C3,被证明对感染单纯疙疹
病毒的老鼠具有保护作用"这种保护作用与感染后注射IC3的时间有关,立即注射可
使87.5%的老鼠存活,并且可使老鼠平均死亡时间推后;感染后24或者48小时注射
却不能显著提高老鼠的存活率[40]"钝顶螺旋藻中的硫酸化多糖（Ca-sP）能抑制少数有包
膜病毒的复制,其中形成钙离子鳌和物和硫酸根是Ca-SP抗病毒所必需的[4l]"海藻硫
酸多糖可明显干扰HW与宿主细胞的吸附,因为硫酸多糖中带负电的硫酸基,可与带
正电的Hlv-1的蛋白外壳gP120上的氨基酸相互作用,从而阻止了Hlv-1对T淋巴细
胞的吸附"总之,多糖的抗病毒活性是通过干扰病毒的吸附!
侵入宿主细胞的过程,
抑制逆转录酶的活性,抑制病毒RNA的整和!
逆转录过程,提高机体免疫力等实现
的[4,,4,]"
1.2.2.3免疫调节活作用
多糖的免疫调节作用是其最重要的作用,它能在多条途径!
多个层面对免疫系统
发挥作用"它主要通过以下几个途径实现:
激活巨噬细胞!
T淋巴细胞!
B淋巴细胞!
自然杀伤协胶）细胞!
细胞毒T细胞和淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞等免疫细胞,促
进细胞因子生成,活化补体[.2]"研究表明,褐藻糖胶任ucofdan）体内给药可增强小鼠T
细胞!
B细胞!
巨噬细胞和NK细胞的功能,体外给药可诱导白细胞介素及干扰素的产生=441"小球藻多糖可以显著提高噬菌指数!
噬菌率及耳肿胀度[45〕"螺旋藻多糖能明
显地促进小鼠脾细胞对丝裂原刀豆素A的增殖反应,提高小鼠机体的免疫功能[46]"极
大螺旋藻胞外多糖可提高小鼠NK的活力,促进白细胞介素产生及增强淋巴细胞和混
合淋巴细胞的转化功能147]"螺旋藻多糖还能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指
数,提高外周血中T淋巴细胞的百分数和血清溶血素的含量[48〕"日本研究人员发现一
种褐藻（Laminartajoponica）的热溶提取多糖可以促进对脾细胞多克隆抗体（IgM和
IgG）的生成[49l"褐藻岩藻糖胶能提高受辐射的小鼠的存活率并能降低很多辐射损伤
指标[50]"
1.2.2.4抗氧化!
抗衰老作用
近年来的研究表明,过多的活性自由基对吞噬细胞本身及其它细胞,组织及生物
大分子有破坏作用,而脂质过氧化加速又可造成正常细胞的破坏与死亡15.]"海藻硫酸
多糖（SPS）具有消除活性氧的作用,是有效的自由基清除剂[52]"褐藻提取物有很强的
抗氧化活性,在酶浓度为30m叭时,对DppH清除率明显高于茶多酚及人工合成抗
氧化剂BHT
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