养殖细胞生物学实验指导书.docx

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养殖细胞生物学实验指导书

目录

实验一细胞凝集反应

实验二细胞膜的渗透性

实验三线粒体和液泡系的超活染色与观察

实验四细胞中多糖和过氧化物酶的定位

实验五DNA和RNA的细胞化学——Feulgen反应和Brachet反应

实验六动物染色体标本的制备与观察

实验七植物细胞骨架的光学显微镜观察

实验八细胞核与线粒体的分级分离

第一部分细胞生物学实验

实验一细胞凝集反应

实验原理

细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。

目前认为：

细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。

凝集素（lectin）是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。

凝集素是细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

实验用品

1．器材

显微镜、粗天平、载玻片、滴管、离心管

2．试剂

PBS缓冲液、生理盐水

3．材料

土豆块茎、2％的红细胞

实验方法

1．用肝素润洗一次性注射器，抽取鱼血，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配制成2%的红细胞液。

2．称取土豆去皮块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素。

3．用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。

4．以PBS滴加2%血细胞液作对照实验。

实验二细胞膜的渗透性

实验原理

将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血。

由于溶剂透入速度各不相同，因此溶血时间也不相同。

实验用品

1．器材

50ml小烧杯，10ml移液管，试管，试管架

2．试剂

0.17mol/L氯化钠、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮

3．材料

鱼血

实验方法

1．羊血细胞悬液

用肝素润洗一次性注射器，抽取鱼血，取50ml小烧杯一只，加1份鱼血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鱼血。

2．低渗溶液

取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释的鱼血，之一观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100％红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。

3．鱼红细胞的渗透性

（1）取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的鱼血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？

有无溶血现象？

为什么？

（2）取试管一支，加入0.12mol/L硫酸钠溶液10ml，再加入1ml稀释的鱼血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？

有无溶血现象？

若发生溶血，记下时间。

（3）分别再另外几种等渗溶液中进行同样实验。

步骤同2。

实验三线粒体和液泡系的超活染色与观察

实验原理

超活染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。

它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。

超活染色可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。

体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活染是由活的动植物分离出部分细胞或组织块，以染料溶液浸没，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

在超活染色中应选择对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配制成稀淡的溶液来使用，一般是以碱性染料最为适用，可能是由于它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。

詹纳斯绿B（JanusgreenB）和中性红（neutralred）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

詹纳斯绿B可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

中性红对液泡系（高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中的某些蛋白质有关。

实验用品

1．器材

显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、表面皿、吸管、牙签

2．试剂

（1）Ringer溶液

氯化钠0.85g氯化钾0.25g

氯化钙0.03g蒸馏水100ml

（2）1%、1/3000中性红溶液

称取0.5g中性红溶于50mlRinger液，稍加热（30-40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，即为1%中性红溶液，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。

临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger液混匀，即成1/3000中性红工作溶液。

（3）1%、1/5000詹纳斯绿B溶液

称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger液，稍加热（30-40℃）使之很快溶解，用滤纸过滤，即为1%原液。

临用前，取已配制的1%原液1ml，加入49mlRinger液混匀，即成1/5000工作溶液。

3．材料

（1）人口腔上皮细胞

（2）洋葱鳞茎内表皮细胞

实验方法

一、人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察

1．取清洁载玻片放在37℃℃恒温水浴锅上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B溶液。

2．实验者用牙签宽头在自己口腔黏膜上刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放入载玻片的染液滴中，染色10~15min（注意不可使染液干燥，必要时可再滴加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。

3．低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观察。

可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。

二、洋葱鳞茎内表皮线粒体和液泡系的超活染色观察

1．撕取洋葱鳞茎内表皮，放在加有一滴1/3000中性红染液的载玻片中，染色5~10min，用吸水纸吸去中性红染液，换上Ringer液，盖上盖玻片，显微镜观察，可见到被染成砖红色的中央大液泡。

2．撕取洋葱鳞茎内表皮，放在加有一滴1/5000詹纳斯绿B染液的载玻片中，染色10~15min，用吸水纸吸去中性红染液，换上Ringer液，盖上盖玻片，显微镜油镜下观察。

可见到细胞中央被一大液泡占据，细胞核被挤至一边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。

实验四细胞中多糖和过氧化物酶的定位

实验原理

利用高碘酸－希夫（Schiff）试剂反应，简称PAS反应，可对细胞内存在的多糖进行定位。

主要是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强氧化剂能打开C-C键，使多糖分子中的乙二醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与希夫试剂反应形成紫红色化合物。

颜色的深浅与糖类的多少有关。

细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色络合物，根据蓝色或棕色的出现即可显示过氧化物酶的存在。

实验用品

1．器材

显微镜、镊子、培养皿、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸

2．试剂

（1）高碘酸溶液

高碘酸（HIO4·H2O）0.4g95%乙醇35ml

1/3mol/L乙酸钠溶液5ml蒸馏水10ml

（2）Schiff试剂

称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5min（勿使之沸腾），使之充分溶解。

然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCL,冷却至25℃时，加入0.5gNa2S2O5（偏重亚硫酸钠），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h（有时需2～3d），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1min，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。

滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。

如有沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。

（3）亚硫酸水溶液

取200ml自来水，加10ml10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钠）水溶液和10ml1mol/LHCL,S三者于使用前混匀。

（4）70％乙醇。

（5）联苯胺溶液

在0.85％盐水内加入联苯胺至饱和为止，临用前加入20％体积的H2O2,每2ml加一滴。

（6）0.1％钼酸铵溶液

称取0.1g钼酸铵溶于100ml0.85％盐水。

3．实验材料

马铃薯块茎、洋葱根尖或洋葱鳞茎。

实验方法

一、细胞中多糖的测定

高碘酸－希夫（PAS）反应

1．把马铃薯块茎用刀片徒手切成薄片。

2．浸入高碘酸溶液5～15min

3．移入70％乙醇中浸片刻。

4．Schiff试剂染色15min。

5．亚硫酸溶液洗3次，每次1min。

6．蒸馏水洗片刻。

7．装片镜检。

二、细胞中过氧化物酶的测定

联苯胺反应

1．把洋葱根尖徒手切成20～40µm厚的薄片或用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块。

2．浸在溶有0.1％钼酸铵的0.85％盐水溶液中5min（钼酸铵的作用是催化剂）。

3．浸在联苯胺溶液内2min至切片出现蓝色。

4．在0.85％盐水溶液中洗1min。

5．将薄片置于载玻片上展开，盖上盖玻片，显微镜检查。

实验五DNA和RNA的细胞化学——Feulgen反应和Brachet反应

实验原理

DNA和RNA是细胞中重要生命物质。

DNA是遗传信息载体，决定生物体的遗传结构，主要存在于细胞核中，在线粒体和叶绿体中有少量存在；RNA传递DNA的遗传信息，并对基因表达起着重要的调控作用。

Feulgen反应和Brachet反应分别创立于1924和1940年。

前者是显示DNA的特异性反应；后者用以区别细胞中的DNA和RNA。

Feulgen反应：

DNA利用稀盐酸水解后使嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，脱氧核糖的C端形成游离的醛基。

游离的醛基与Schiff试剂的无色品红反应形成紫红色化合物，是细胞内含有DNA的部位呈现紫红色。

Brachet反应：

甲基绿和派洛宁（methylgreen/pyronin）均为碱性染料，二者分属三芳基甲烷和氧杂蒽衍生物，与酸性的核酸具有亲和力，可以形成化学键而呈现出特殊的颜色反应。

在pH为4.6-4.8时，二者与两类核酸发生竞争性结合。

甲基绿分子具有2个正电荷N基团，与聚合程度较高的DNA具有较强的亲和力，而使富含DNA区域显示蓝色或绿色。

派洛宁只有1个带正电荷N基团，与低聚分子RNA中的磷酸基团具有较强的亲和力，而使RNA区域显示红色。

这一反应对pH敏感，脱水过程、染料的纯度和染料的结合力都影响到染色效果。

甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。

其原理可能是两种染料的结合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。

甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。

而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。

实验用品

1．器材

显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸

2．试剂

3．试剂

（1）Schiff试剂

（2）1mol/LHCL：

取8.25ml密度为1.19g/ml的浓盐酸加蒸馏水至100ml。

（3）10%亚硫酸钠水溶液

（4）1mol/L乙酸缓冲液（Ph=4.8）

A液：

冰乙酸6ml加蒸馏水至1000mlB液：

乙酸钠13.5g加蒸馏水至1000ml。

用时，取A液40ml+B液60ml混匀即为pH=4.8

（5）Unna试剂：

甲基绿－派洛宁染色液

甲液：

5％派洛宁水溶液6ml

2％甲基绿水溶液6ml

蒸馏水16ml

乙液：

1mol/L乙酸缓冲液16ml

甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时甲乙两液等量混匀。

3．材料

洋葱鳞茎

实验方法

一、Feulgen反应

1．用镊子撕取一小块洋葱鳞茎内表皮，置于预热至60℃的1mol/LHCL中水解8-10min，蒸馏水洗涤。

2．Schiff试剂避光染色30min。

3．浸入亚硫酸钠溶液中3min，蒸馏水洗片刻。

4．盖上盖玻片，镜检。

二、Brachet反应

1．用镊子撕取一小块洋葱鳞茎内表皮，置于载玻片上。

2．滴一滴Unna试剂，染色15-20min。

3．蒸馏水洗三次，吸水纸吸去多余水分。

（注意：

不能在蒸馏水中浸泡太久，否则派洛宁会褪色）。

5．盖上盖玻片，镜检。

【注意事项】

①Pyronin可加热助溶。

②Methylgreen批号不同，染色效果差别很大。

商品甲基绿常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。

实验六动物染色体标本的制备与观察

实验原理

凡细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂的任何动物组织，均可用于染色体分析。

在正常动物体内，骨髓时处于不断分裂的组织之一。

给动物注射一定剂量的秋水仙素即可使处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。

实验用品

1．器材

离心机、显微镜、10ml刻度离心管、1ml注射器、烧杯、100ml量筒试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管、载玻片

2．试剂

（1）100mg/ml秋水仙素溶液

（2）1%柠檬酸钠溶液

（3）0.4%KCl溶液

（4）Giemsa（姬姆萨）原液

Giemsa粉1g甘油33ml甲醇45ml

将Giemsa粉倒入研钵，加入几滴甘油，研磨至无颗粒为止，再将剩余甘油全部倒入，放于60~65℃保温箱中保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用。

（5）0.067mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）

（6）1:

10Giemsa磷酸缓冲液染液

（7）卡诺固定液：

甲醇:

冰醋酸＝3:

1

3．材料

虎纹蛙

实验方法

1．虎纹蛙按30µg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，7~8h后杀死动物，取后肢股骨和胫骨，剥离全部肌肉，剪去股骨和胫骨两端。

2．将1ml1%柠檬酸钠溶液用1ml注射器注入骨髓腔，细胞冲入小烧杯或培养皿内。

3．反复吸打，使分散成单个细胞。

4．将骨髓细胞转入离心管，视细胞量加入事先预热至26℃的0.4%KCl溶液8~10ml，置26℃水浴低渗30min。

5．以1000r/min离心8min。

6．弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇:

冰醋酸（3:

1）固定液5ml。

7．将细胞团轻轻吸打均匀，静置固定20min。

。

8．重复5~7步1~2次。

9．再次离心后，吸去上层固定液，加入新的固定液吸打成悬液。

10．在干净、湿、冷的载玻片上滴2~3滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干或自然晾干。

11．每片玻片滴加1:

10Giemsa磷酸缓冲液染液3~4ml，染色10min。

12．蒸馏水或自来水冲洗掉多余染液（注意水流一定要平缓），显微镜下观察。

实验七植物细胞骨架的光学显微镜观察

实验原理

细胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。

他们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输、能量转换、信息传递、基因表达等起到重要作用。

当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而保存。

经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，这就是细胞骨架。

实验用品

1．器材

显微镜、烧杯、滴管、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、吸水纸、擦镜纸

2．试剂

（1）M-缓冲液：

50mmol/L咪唑、50mmol/LKCl、0.5mmol/LMgCl2、1mmol/LEGTA[乙二醇双（α－氨基乙基）醚四乙酸]、0.1mmol/LEDTA、1mmol/L巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）。

（2）6mmol/L磷酸缓冲液（pH6.8）。

（3）1%TritonX-100，用M-缓冲液配制。

（4）0.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂为：

甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。

（5）3%戊二醛，用

（2）液配制。

（6）50%、70%、95%乙醇。

（7）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶

3．材料

洋葱鳞茎

实验方法

1．撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm2大小）置于装有磷酸缓冲液的烧杯中，使其下沉。

2．吸去磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理20~30min。

3．吸去1%TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，每次10min。

4．3%戊二醛固定0.5~1h。

5．磷酸缓冲液洗三次，每次10min。

6．0.2%考马斯亮蓝R250染色20~30min。

7．用蒸馏水洗1~2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，显微镜下观察

8．如观察效果好，可制作成永久切片：

将经蒸馏水洗的样品，顺序通过下列试剂：

50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、95%乙醇+叔丁醇（1:

1）、叔丁醇；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯，每级5~10min，然后捞取样品，镜检，效果好的，可加一滴中性树胶封片。

实验八细胞核与线粒体的分级分离

实验原理

在一定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径核悬浮介质的黏度。

在一均匀悬浮介质中离心一段时间后，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度的不同而停留在高低不同的位置。

依次增加离心力和离心时间，就可以使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。

悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器结构和酶的活性，有利于分离。

同时，该方法中采用的CaCl2有稳定细胞膜的作用。

整个操作应保持在4℃以避免酶失活。

实验用品

1．器材

高速冷冻离心机、显微镜、天平、玻璃匀浆器、解剖刀剪、烧杯、量筒、高速离心管、玻璃漏斗、尼龙布、载玻片、盖玻片

2．试剂

0.9%生理盐水、0.25mol/L蔗糖+3mmol/LCaCl2匀浆液、1%甲苯胺蓝溶液、1/5000詹纳斯绿B染液

3．材料

罗非鱼肝脏

实验方法

一、细胞核的分离提取

1．将罗非鱼击头处死，迅速剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中去除结缔组织并剪成小块，尽快置于预冷的生理盐水中，反复洗涤，尽量除去血液，用滤纸吸去表面液体。

2．将剪碎的肝组织移入玻璃匀浆管中，加入适量匀浆液，冰浴匀浆，匀浆液用蔗糖/CaCl2溶液预湿的尼龙布过滤于离心管中。

3．将装有滤液的离心管以2500g，4℃离心15min，取上清液，移入高速离心管中并保存于冰浴中，待分离线粒体用。

4．收集的沉淀以少量蔗糖/CaCl2溶液重新悬浮，以2500g离心15min，取上清与3收集的上清液一同保存。

5．将沉淀用少量蔗糖/CaCl2溶液重新悬浮，职称细胞核悬液，滴一滴于干净的载玻片上，做成涂片，自然干燥。

6．涂片用1%甲苯胺蓝染色，光镜下观察。

二、差速离心分离提取线粒体

1．将装有上清液的高速离心管配平后，17000g，4℃离心20min，弃上清，收集沉淀。

2．加入蔗糖/CaCl2溶液1ml，用吸管吹打成悬液，17000g，4℃离心20min，将上清液加入另一试管，沉淀加入0.1ml蔗糖/CaCl2溶液制成悬液。

3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片，各滴一滴1/5000詹纳斯绿B染液染色20min，镜检（为有利于线粒体的有氧呼吸，可不必加盖玻片）。

可见有活性的线粒体进行活跃的运动，并且着色成蓝绿色。

【注意事项】

（1）如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品在各步骤的冷冻，以保持线粒体的生理活性。

（2）动物材料实验前可空腹过夜，以降低肝脏组织中的脂肪含量，便于实验操作。

（3）实验中必须注意保持细胞器的完整性，避免过于剧烈的机械操作。

尤其是线粒体必须在保持了呼吸氧化功能时才能被活性染色法检测。