土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定3.docx
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土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定3
土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定
1实验目的
1.1.了解生物分离提纯的原理和方法技术
1.2.掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法
1.3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法
1.4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力
1.5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
2实验原理
自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
为了获得某种微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而淘汰其他一些不需要的微生物,再用稀释涂布平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物,直到得到纯菌株。
在自然界的土壤中有可能分布着能产淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土壤悬液杀非芽孢细菌、平板分离可获得细菌的单菌落，经革兰氏染色、芽孢染色可判断分离菌株是否为芽孢杆菌，将单菌落点接含有淀粉的平板，凡是具有产淀粉酶能力的的芽孢杆菌能水解淀粉，从而在淀粉平板上菌落周围会出现水解圈，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
由此可将产淀粉酶能力的菌株分离，分离后再进一步划线纯化，对分离出的各菌株可通过形态观察及染色，得到纯培养的芽孢杆菌。
根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点，选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种，通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从而鉴定出目的菌的种别。
芽孢杆菌属的共同特征是：
革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源
3材料与方法
3.1.材料
培养基淀粉固体培养基，
3.2方法
3.2.1土壤采集
从广州大学生化楼树林处和竹苑果园里采集地下5—20cm处熟化、有机质含量高的肥沃土壤各一份，观察土壤的颜色并记录采集时间、所在的生态环境。
对土壤做以下的处理，将采集到的两份土壤各加入50g可溶性淀粉，拌匀后，轻拍土壤，培养5d。
3.2.2分离纯化
制备悬液：
分别称取土样5g，放于各自装有45ml无菌水的锥形瓶中振荡10min，即为稀释10-1的土壤菌悬液，编号为1、2。
将菌悬液置于80℃恒温水浴装置中水浴20min,筛选出有芽孢的菌。
梯度稀释菌悬液：
分别取装有9ml无菌水试管8支，配制浓度为10-2、10-3、10-4、10-5的菌悬液。
用无菌的移液枪取已稀释成10-1的土壤菌悬液1ml加入无菌水的试管中，在试管内轻轻反复吹吸数次，使之混匀，即成10-2土壤稀释液。
同样的方法从浓度为10-2的试管中吸取1mL稀释液加入无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。
（注：
在土壤稀释过程中用相同的移液枪头由浓到稀进行稀释。
）
涂布接种：
取100uL各浓度的菌悬液于淀粉牛肉膏蛋白胨培养基上，用无菌玻璃涂棒涂匀，每个浓度做2个平板，倒置于37℃下恒温培养24h。
划线接种（分区划线法）：
在上述不同稀释浓度的培养基中挑取不同单菌落进行分区划线，培养基分成A、B、C、D四个区，先在平板培养基的A区做第1次平行划线3~4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。
划线完毕，盖上皿盖，倒置于37°C下恒温培养约24h.。
再继续分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。
将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做实验。
获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：
在获得纯化的单菌落周围加卢戈氏碘液，观察菌落周围是否出现透明水解圈，并测定菌落及水解圈直径，计算其比值（HC比值），挑取比值较大的菌种，一部分接种到斜面用以保存菌种（接2支），另一部分用来做实验。
3.2.3初步鉴定
（一）形态鉴定
（1）革兰氏染色：
涂片、干燥及固定
初染：
在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
媒染：
先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
脱色：
除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。
复染：
滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。
镜检：
用油镜观察。
（2）芽孢染色：
涂片、干燥及固定
加温染色：
加5%孔雀绿染色液于玻片上，微火加热至冒蒸汽维持5分钟。
水洗将玻片冷却，水洗直到流出的水中无绿色为止。
常温复染：
加番红染色2分钟后，倾去染色液，水洗，直接用吸水纸吸去余水。
镜检：
用油镜观察。
3.2.4生理生化实验
（一）明胶水解试验
有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
方法：
挑取纯化的单菌落培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。
于20-22℃培养7-14天。
明胶高层亦可培养于36±1℃。
每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。
平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10-20min后，菌落周围应出现清晰带环。
否则为阴性。
（二）糖类发酵试验
可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。
是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。
是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
流程：
发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录
（1）操作前注意观察未接种细菌的正常单糖发酵管状况。
（2）接种培养
以无菌操作分别将少量纯化的单菌落培养物接种于木糖发酵管、阿拉伯糖发酵管、甘露醇发酵管及葡萄糖发酵管中；每种菌落两支试管做平行对照，每种糖发酵管的空白对照均不接菌。
置37℃恒温箱中培养，分别培养24h观察结果。
（3）观察记录
与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
（三） 乙酰甲基甲醇试验（V．P试验）
某些芽孢杆菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
流程：
培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录
（1） 标记试管
取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别做上标记。
（2） 接种培养
以无菌操作分别接种少量单菌落至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24h。
（3）观察记录
取出以上试管，充分振荡2min。
每管分别加入40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。
注意：
原试管中留下一半培养液用作甲基红试验。
（四） 甲基红试验（M.R.试验）
某些芽孢杆菌发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
. 流程培养液→指示剂→观察→记录结果
于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
（五）吲哚试验
有些芽孢杆菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（靛基质）。
吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。
流程：
标记试管→接种→培养→观察→记录
（1） 试管标记
取装有蛋白胨水培养液的试管，分别做上标记。
（2）接种培养
以无菌操作分别接种少量单菌落到以上相应试管中，空白对照管不接种，置37℃恒温箱中培养24h。
（3） 观察记录
在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。
（六）苯丙氨酸脱氨酶测定
有些芽孢杆菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能使苯丙氨酸氧化脱氨形成苯丙酮酸。
苯丙酮酸与FeCl3起反应后呈现蓝绿色。
（1）编号：
取苯丙氨酸斜面培养基，分别做上标记。
（2）接种：
按标记接种后置于37℃恒温箱中培养24h。
（3）观察：
加10%FeCl3试剂4-5滴于斜面上，若斜面与试剂相接触的界面出现蓝绿色者为阳性反应，以“+”表示；无变化则以“—“表示。
（七）温度对微生物生长的影响（温度试验）
将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。
（培养基厚度为一般培养基的1.5到2倍）
取牛肉膏蛋白胨固体培养基，分别进行标记。
在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种2个平板。
各取每个菌种两套平板倒置于4℃、20℃、37℃，60℃下保温培养24小时，观察细菌的生长状况。
（“—”不生长，“+”生长较差，“++”生长一般，“+++”生长良好。
）
（八）耐盐性试验
将分离获得纯化的单菌落细菌分别接种在NaCl浓度为2%，10%，20%，25%的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37℃下培养,观察细菌的生长情况[7]。
（“—”不生长，“+”生长较差，“++”生长一般，“+++”生长良好。
）
（九）硝酸盐还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
方法：
取硝酸盐培养基，做上标记。
将菌种接种于培养基中，空白对照不用接种，于37℃恒温箱中培养24h。
临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。
（用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。
进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。
α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
）
（十）酪素水解试验
牛奶平板的制备：
取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。
待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。
将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。
37℃培养，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。
（十一）酪氨酸水解试验
L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，倾倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，37℃培养，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。
（十二）柠檬酸盐利用试验
有些细菌可以利用柠檬酸盐作为唯一的炭盐，而有些细菌则不能利用，因此可作为鉴定细菌的指标之一。
由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基pH由中性变为碱性，培养基中的指示剂由浅绿色变为蓝色。
编号：
取西蒙斯氏柠檬盐培养基，做上标记。
接种：
在以上的培养基接种，置于37℃恒温箱培养24h。
观察：
如果培养基变为蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源生长，即为阳性反应，以“+”表示。
如果培养基仍为绿色则为阴性反应，以“—”表示。
（十三）运动性试验
使用半固体营养琼脂试管，将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底1-1.5cm处，沿原穿刺线拔出接种针，置于37℃恒温箱培养24h。
观察是否产生树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，若直立生长，则菌株无鞭毛。
（十四）马尿酸盐水解试验
马尿酸钠1g，牛肉膏蛋白胨培养基100ml；三氯化铁试剂：
三氯化铁12g溶于2%盐酸100ml中；将马尿酸钠和牛肉膏蛋白胨培养基（pH7.8）加热溶解后分装于试管中，每管4ml，121℃灭菌，备用。
取纯菌接种培养基，37℃培养24h，观察培养基液面。
如液面下降时以蒸馏水补充之。
离心沉淀，取上清液0.8ml加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀。
经10～30min观察结果，出现稳定沉淀物为阳性。
反之为阴性。
3.2.5确定菌株
根据生理生化试验的结果，查阅伯杰氏细菌鉴定手册，确定菌株的菌种。
本次实验根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点，选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种，其生理生化指标如下表：
革兰氏
耐盐试验
VP试验
吲哚试验
糖发酵试验
糖发酵气
柠檬酸盐
明胶试验
葡
木
阿
甘
枯草芽孢杆菌
+
+
+
+
+
+
+
—
+
+
地衣孢杆菌
+
+
+
+
+
+
+
—
+
w
蜡状孢杆菌
+
+
+
+
—
—
—
—
+
巨大孢杆菌
+
+
+
+
w
w
w
—
+
+
多粘孢杆菌
d
+
—
+
+
+
+
+
环状孢杆菌
d
—
—
+
+
+
+
—
w
凝结孢杆菌
+
—
d
—
+
w
w
w
—
蜂房孢杆菌
d
—
+
+
+
—
—
—
—
坚硬孢杆菌
+
+
—
—
w
w
w
+
—
短孢杆菌
d
—
—
—
d
—
—
w
—
球形孢杆菌
d
w
—
—
—
—
—
—
—
差大
巴氏孢杆菌
d
—
—
—
w
马尿酸盐水解
运动
试验
苯丙氨酸脱氨
硝酸盐还原
酪素水解试验
卵黄反应试验
温度试验
最高
最低
枯草芽孢杆菌
—
+
+
+
—
45-55
5-20
地衣孢杆菌
—
+
+
+
—
50-55
15
蜡状孢杆菌
w
+
+
+
35-45
10-20
巨大孢杆菌
w
w
+
—
35-45
3-20
多粘孢杆菌
+
—
+
+
35-45
5-10
环状孢杆菌
w
—
—
w
35-50
5-20
凝结孢杆菌
+
—
w
w
55-60
15-25
蜂房孢杆菌
w
—
—
+
35-45
15-20
坚硬孢杆菌
w
w
+
+
40-45
5-20
短孢杆菌
+
—
w
+
40-60
10-35
球形孢杆菌
+
+
—
w
30-45
5-15
巴氏孢杆菌
+
d
d
33-42
阳性：
+；阴性：
—；阳性和阴性不稳定：
d；弱阳性：
w；
通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从而鉴定出目的菌的种别；
3.2.6产淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶活性的测定（3，5-二硝基水杨酸显色法）
（1）粗酶液制备：
以一环菌种接种于发酵培养基中，摇床培养，160rpm/min,37℃，48h。
4000rpm/min离心20min，收集上清液即为待测粗酶液。
（2）1mg/mL标准麦芽糖的制备：
准确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水准确定容到100mL；
（3）3，5-二硝基水杨酸试剂的制备：
准确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水定容到100mL，盖紧瓶塞，备用；
（4）0.1mol/LPh5.6的柠檬酸缓冲液的制备
准确称取4.62g柠檬酸和17.05g柠檬酸钠，用蒸馏水定容至800mL；
（5）1%淀粉溶液的制备
准确称取1g淀粉于100mL0.1mol/LPh5.6的柠檬酸缓冲液中；
（6）标准曲线的绘制
取7支20ml预先洁净灭菌干燥的试管，编号，加入试剂见表1
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
7
麦芽糖标准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0
麦芽糖含量/mg
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）
1.5
标准样液配制按上表配制完成，摇匀，置沸水浴中煮沸10min。
取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。
以一号管作为空白对照管，520nm比色测定吸光度。
以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（7）测定
取10ml具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥、编号。
按下表配制溶液，定容后，摇匀，用分光光度计测定OD在520nm的值。
菌1
菌2
菌3
A
B
空
A
B
空
A
B
空
粗酶液（mL）
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）
0
0
2.0
0
0
2.0
0
0
2.0
预温：
40℃水浴10min
1%淀粉溶液（mL）
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
精确保温：
40℃水浴5min
3,5-二硝基水杨酸（mL）
2.0
2.0
0
2.0
2.0
0
2.0
2.0
0
（8）计算
根据测到的OD值，在标准曲线中找到相应的麦芽糖量，并在上述条件下以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位（MMU）酶活力，按下式计算出淀粉酶的活力。
淀粉酶活力=麦芽糖释放量（mg）·6·稀释倍数
4.注意事项及可能存在的问题
4.1严格遵守无菌操作要求，防止污染情况发生；
4.2称取药品过程中，药勺不要混用，避免交叉感染，称完药品要及时盖上盖子，放回原位；
4.3革兰氏染色注意控制好脱色时间，过长过短都会影响实验结果；
4.4调pH是小心操作，避免回调，从而引起误差；
4.5在芽孢染色过程中，注意温度的控制，避免因菌体细胞破裂而释放大量游离芽孢；
5.预期实验结果
通过对土壤中微生物的分离和筛选，得到3种以上的产淀粉酶芽孢杆菌，并通过生理生化试验成功将其一一鉴定，进一步测定各菌种的淀粉酶活力，总结出各菌种的特性和应用价值。
6.参考文献
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