原生质体的制备与再生毕业开题报告论文.docx
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原生质体的制备与再生毕业开题报告论文
淮阴工学院
毕业设计（论文）开题报告
学生姓名：
严闯
学号：
1121602115
专业：
生物工程
论文题目：
Trichodermaasperelloides原生质体的制备与再生
研究
指导教师：
方芳
2016
年
2
月
13
日
毕业论文开题报告
1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000字左右的文献综述
文献综述
1引言
原生质体概念：
用水解酶将细胞壁水解剥离，剩下由原生质体膜包围着的原生质体部分称为原生质体（protoplast）。
其形状随不同菌类而异。
原生质体基本保持原细胞结构、活性和功能，只是因为去掉了细胞壁，对渗透压和外界环境特别敏感。
为制备原生质体，必须有效地除去细胞外的细胞壁。
去壁的方法有机械法、非酶分离法和酶法。
实际工作中绝大多数采用酶法，时间短，效果好。
即用水解酶除去细胞壁，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体的过程。
不同微生物种类其细胞壁结构和化学组成不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此要根据微生物种类特性选择合适的酶。
本次实验是针对Trichodermaasperelloide的，所以选取的是蜗牛酶，溶菌酶，纤维素酶[1]。
Trichodermaasperelloides是从棘孢木霉中分出的新种，它与木霉属、曲霉属等形态学基本没有区别，但分子序列标记不同。
目前国内少见该菌种的报告，但是有关该菌种产纤维素酶的报道。
研究表明该菌种能较好地利用农业废弃物为底物生产纤维素酶，并利用紫外、微波对该菌株进行了复合诱变，选育出一株产酶活力高的突变菌株TrichodermaasperelloidesZWWB1。
但是影响纤维素酶产量和活力的因素，除菌种外，还有发酵基质、温度、pH、水分及发酵时间等；同时还有纤维素酶的生产方式。
另外Trichodermaasperelloide是一种广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤的一个常见菌种。
Trichodermaasperelloide是重要的发酵工业菌种，在工业酶制剂、有机酸发酵方面被广泛应用，此菌有很强的纤维素霉及纤维,二糖淀粉酶等,它能利于农副产品,如麦杆,木材,木屑等纤维素原料,使之转变为糖质原料[2]。
因此采用各种方法对Trichodermaasperelloide进行菌种改良以提高目标产物的产量及质量是一直被科学家研究的方向。
本课题研究的是Trichodermaasperelloide原生质体的形成率和再生率，通过改变酶解温度、裂解酶组成比例对原生质体的形成、再生进行了初步研究。
1.1原生质体及Trichodermaasperelloide的主要特性
1.1.1原生质体的主要特性
1.1.1.1原生质体的定义
原生质体（protoplast）是指脱去细胞壁的细胞，是一生物工程学的概念；动物细胞也可算做原生质体。
原生质体是组成细胞的一个形态结构单位。
原生质体由原生质分化形成，具体包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器。
原生质体是细胞进行各类代谢的主要场所，是细胞中重要的部分[3]。
1.1.1.2原生质体的特性
原生质体指在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的细菌。
革兰阳性菌最易形成原生质体。
原生质球指革兰阴性菌肽聚糖层受损后尚保留有外膜的原生质体。
原生质体，它是细胞进行各类代谢的主要场所，是细胞中重要的部分。
原生质体可分为质膜、细胞器、胞基质三部分[4]。
1.1.1.3原生质体制备基本方法
现在较成熟高效的方法是酶解法。
将一定量的纤维素酶、蜗牛酶及溶菌酶溶于渗透压稳定剂，充分振荡溶解后，3000r/min离心15min，用0.22μm滤膜过滤除菌；配制成0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶+0.5%溶菌酶的混合酶液。
低温保存待用[5]。
1.1.2Trichodermaasperelloide主要特性
1.1.2.1Trichodermaasperelloide的特性
Trichodermaasperelloide是从棘孢木霉中分出的新种，广泛存在于不同环境条件下的土壤中。
自19世纪中叶，人类对棘孢木霉菌已有了初步的认识，但直到上世纪60年代木霉菌的分类地位才得以确定。
大多数木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质，比如细胞壁降解酶类和次级代谢产物，并能提高农作物的抗逆性，促进植物生长和提高农产品产量，因此被广泛用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂[6]。
1.1.2.2Trichodermaasperelloide的选择
本次实验选取的是本校实验室分离纯化的木霉菌种，经过在培养基上接种，恒温培养箱中培养选择生长较好的菌种。
2影响Trichodermaasperelloide原生质体制备与再生的因素
2.1酶解时间对原生质体制备的影响
酶解时间的长短对原生质体活性的影响很大，酶解时间短，可使得原生质体保持较高的活性，但是不能保证原生质体充分释放；酶解时间长，虽然能够使原生质体充分释放，但是由于酶解时间过长，对原生质体的活性造成一定的伤害，所以本实验通过改变几个酶解时间梯队，来探究最佳酶解时间。
。
2.2酶解温度对原生质体制备的影响
因为本次实验所用的复合酶制剂是按照将一定量的纤维素酶、蜗牛酶及溶菌酶溶于渗透压稳定剂，充分振荡溶解后，3000r/min离心15min，用0.22μm滤膜过滤除菌；来配制成0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶+0.5%溶菌酶的混合酶液的。
我们知道生物酶制剂对温度有较强的敏感性，所以改变几个时间区间来探寻其对原生质体制备的意义。
2.3摇瓶种子液培养时间对原生质体制备的影响
取活化好的固体斜面培养基，加入5mL无菌水，振荡摇匀，制成孢子悬液备用。
在盛有20mL菌丝体培养基（生长培养基）的50mL三角瓶中，按1:
20的比例用灭菌好的刻度吸管在无菌室内吸取孢子悬液1mL接入三角瓶，置于28℃下摇床振荡培养12h，24h，36h,观察液体培养基长出菌丝球状况，发现不同培养时间，原生质体的制备率与再生率也不同。
2.4渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
渗透压稳定剂在不同过程中的效果不同，在没接过程中以蔗糖为渗透压稳定剂的效果好，而在原生质体再生时，则以氯化钾为渗透压稳定剂效果好，由此可见，在不同条件下需要选择不同的渗透压调节剂。
在酶解过程中，蔗糖不仅可以满足渗透压调节作用，同时还有可能对细胞壁降解酶的活性产生一定的影响，而氯化钾渗透压调节剂对原生质体有较稳定的效果，通过对比两种渗透压稳定剂选择效果最好的一种。
3木霉原生质体制备与再生研究现状
谭周进，吴铁等研究原生质体微生物菌种报道了酶解时间、酶解温度、实验pH值和渗透压稳定剂等因素对原生质体的制备与再生的影响，结果显示，事宜的酶解时间，30℃.3.0%浓度的氯化钾可以显著提高原生质体的产量与[7]。
黄玉希等研究了绿色木霉T23原生质体的制备与再生发现处于不同生长时期的菌种，对各种溶壁的敏感性不同，原生质体制备率也存在这差异[8]。
谭文辉等研究了微生物原生质体制备及再生的影响因素发现酶解时间对原生质体制备的质量和产量影响较大，充足的酶解时间是原生质体的必要条件。
酶解时间过短，原生质体形成不完全，酶解时间过长，必然影响原生质体的再生率[9]。
葛文中等研究绿色木霉的应用，结果表明绿色木霉对微生物的育种，基因调节，细胞融合有较大的影响[10]。
姚婷婷等研究了渗透压稳定剂对黑曲霉原生质体的制备及再生的影响，结果表明相同浓度的渗透压稳定剂，氯化钾的效果远比蔗糖的效果好。
朱丽云等研究了绿色木霉原生质体制备与再生条件的探索，结果表明，绿色木霉在pH6.0-6.5,30-35℃时，原生质体的再生条件最优化[11]。
郭存刚等用研究黑色木霉原生质体的再生率，改变摇瓶种子液的培养时间，在稀释10倍，100倍，1000倍的基础上分别计数再生菌落，得出结论，即摇瓶种子液培养时间为24h时，原生质体的再生率最高[12]。
叶怀瑾等用单一酶制剂和复合酶制剂分别酶解康宁木霉，发现复合酶制剂在较短时间内就可以获得较稳定的原生质体，而单一酶制剂却需要很长的时间，但是二者最后的产量却没有巨大的差别。
可见酶解只是影响酶解过程并不会对量产生变化[13]。
白晓庆等用研究康宁木霉原生质体制备与再生条件，发现菌龄在22h,蜗牛酶浓度为2.0%，酶解时间2.5小时时可以获得高产原生质体量[14]。
4选题意义
自从1960年酶制剂制备大量原生质体首次获得成功以来，原生质体被广泛应用余生活中各个领域，通过原生质体而发展的技术目前在粮食生产、植物性产品和微生物原生质体的融合、水质净化、单克隆等领域发挥巨大的作用。
作为这些研究的基础，如何更加有效的制备原生质体，如何高效的得到原生质体，影响原生质体制备与再生的因素又是哪些。
一直是学者，科学家研究的方向。
本次实验研究过改变酶解时间，酶解温度，和摇瓶种子液培养时间，渗透压稳定剂等因素探究其对原生质体制备与再生的影响，通过控制变量法和正交实验并运用现代植物微生物学和现代微生物操作技术，遵循最新的操作理论，使用先进的设备，以期找出最适合的制备条件，提高原生质体的制备率和再生率，为原生质体的进一步应用打好基础[13]。
5前景与展望
原生质体制备技术发展成熟以来，通过原生质体为桥梁而发展的技术也有很多。
早期主要应用于原生质体的融合育种技术，异核体杂种的培育，多倍体杂交技术，单克隆体的制备等，其中原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组和杂交的方法。
单克隆体的制备则客服了远缘杂交不亲和的障碍，有利于培育新品种。
此外最近几年原生质体已经越来越广泛应用于植物生理学，细胞生物学，体细胞遗传学等新兴研究领域。
是生理生化研究，基因表达调控研究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合和新品种等研究的理想材料[16]。
目前我国国内外对各种原生质体的研究很多，也产生了不少新的理论与操作方法，以我国的灵芝原生质体的制备与再生研究为例，通过对灵芝原生质体的制备及遗传转化的研究，对于发挥灵芝这一稀有真菌的药用价值以及开展灵芝分子遗传学的研究具有重大意义。
但是我们也应该清楚的认识到原生质体的制备与再生问题还没有完全解决，原生质体的应用也有更大的进步空间。
相信随着更多专业人士和有志之士的努力，原生质体的制备技术会更加完善。
而这将是整个人类的福祉。
参考文献
[1]谭文辉，李燕萍.微生物原生质体制备及再生的影响因素.[J]，南昌：
南昌大学中德联合研究所，2006
[2]王升星，朱丽云.绿色木霉原生质体制备与再生.安徽农业科学，2010（10）:
517~557
[3]刘士旺，王政逸.绿色木霉原生质体的制备与转化条件.农业生物技术学报.浙江：
浙江人民出版社，2004
[4]葛文中，李楠.绿色木霉应用的研究进展.黑龙江八一农垦大学学报.黑龙江，2005（02）:
316~337
[5]姚婷婷，王正向.黑曲霉原生质体的制备及再生.食品与生物技术学报.南京，
2006（04）:
12~36
[6]孙建秋，周东坡.微生物原生质体技术.生物学通报.哈尔滨，2002（07）:
33~93
[7]谭周进，吴铁.原生质体微生物菌种.核农学报.湖南，2005（10）:
231~256
[8]刘霞，杨平平.绿色木霉发酵条件的优化.中国食品添加剂.北京，2010（01）：
12-42
[9]安磊，王燕.木霉的研究.草业科学.江苏.2004（10）:
276-293
[10]刘照人，李坤.原生质体的制备条件.北京：
人民出版社，2010
[11]曹军卫，马辉文-微生物工程[M].北京，科学出版社2007，58-65..
[12]施巧琴，吴松刚.现状工业微生物育种学[M].2版，2007，296-315.
[13]叶怀瑾,赵文顺.康宁木霉原生质体制备研究.微生物学报.芜湖，2014（11）:
56~67
[14]白晓庆，段辉.康宁木霉原生质体制备与再生条件.现代生物学.北京，2008（07）;105~126
[15]马桂英，徐莹莹.原生质体融合的研究.中国微生物.长沙，2008（11）：
312~326
[16]宋金燕，张主业.原生质体的历史与发展.生物近代史.南京，2014（03）；124~129
毕业论文开题报告
2．本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）
1研究或解决的问题
1.通过改变酶解时间、酶解温度、摇瓶种子液培养时间和渗透压稳定剂等因素研究其对原生质体的形成、再生的影响。
2.结合计算机作图，找到影响原生质体制备与再生的最佳条件。
2实验材料和方法
2.1实验菌种、材料及仪器
2.1.1实验菌种
菌种：
本校实验室保藏的诱变Trichodermaasperelloide菌种。
2.1.2实验材料
生长培养基：
PDA培养基再生培养基
无菌复合酶液渗透压稳定剂等
2.1.2实验仪器
高压蒸汽灭菌锅型号：
LDZX-30FBS厂家：
上海申安医疗器械厂
显微镜型号：
XSP-2C厂家：
上海光学仪器厂
37°C恒温培养箱型号：
DHP400厂家：
武汉瑞华仪器厂
实验所用一般培养皿，试管等常规实验室仪器
2.2拟采用的实验方法
2.2.1Trichodermaasperelloide原生质体的制备与再生
2.2.1.1Trichodermaasperelloide原生质体的制备
在灭菌好的无菌操作室将Trichodermaasperelloide菌种接种在试管固体斜面培养基中活化，在28℃恒温箱箱中培养培养120h。
取活化好的固体斜面培养基，加入5mL无菌水，振荡摇匀，制成孢子悬液备用。
在盛有20mL菌丝体培养基（生长培养基）的50mL三角瓶中，按1:
20的比例用灭菌好的刻度吸管在无菌室内吸取孢子悬液1mL接入三角瓶，置28℃下摇床振荡培养24h,待液体培养基长出菌丝球，备用。
取培养24h的摇瓶种子液1mL，置于10mL无菌复合酶液在30℃水浴锅中酶解3h，其间每隔1h取样涂片,用显微镜观察作用情况和原生质体释放情况,3h左右终止酶解。
离心（3000r/min,10min）,弃去上部酶液,用稳渗剂（0.8mol/L氯化钾溶液）清洗原生质体,离心（3000r/min,10min）,弃去清液,重复一遍清洗离心操作。
放在冰箱里保存待用。
2.2.1.2Trichodermaasperelloide原生质体的再生
将制备的原生质体分别稀释10,100,1000倍。
并涂布在PDA和高渗培养基（再生培养基）上28℃培养2天计菌落数
2.2.1.3Trichodermaasperelloide原生质体的的制备率与再生率的计算
解前菌数-剩余菌数
原生质体形成率（%））=*100%
酶解前菌数
再生平板上的总菌数-酶解后的剩余菌数
原生质体再生率（%）=*100%
原生质体数（酶解前总菌数-剩余菌数）
2.2.2通过改变酶解时间，酶解温度，和摇瓶种子液培养时间，渗透压稳定剂等因素探究其对原生质体制备与再生的影响
2.2.2.1酶解时间对原生质体制备的影响
由于细胞壁降解酶是将真菌细胞壁降解，从而使原生质体释放。
酶解时间的长短对原生质体活性的影响很大，酶解时间短，可使得原生质体保持较高的活性，但是不能保证原生质体充分释放；酶解时间长，虽然能够使原生质体充分释放，但是由于酶解时间过长，对原生质体的活性造成一定的伤害，所以本实验通过将培养好的菌丝装入50mL离心管内，加入适当浓度和体积的裂解酶，加入酶后，于28℃下震荡培养，分别培养1h，2h,3h,4h时进行取样，在光学显微镜下观察原生质体的释放方式。
来探究最佳酶解时间。
2.2.2.2酶解温度对原生质体制备的影响
因为本次实验所用的复合酶制剂是按照将一定量的纤维素酶、蜗牛酶及溶菌酶溶于渗透压稳定剂，充分振荡溶解后，3000r/min离心15min，用0.22μm滤膜过滤除菌；来配制成0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶+0.5%溶菌酶的混合酶液的。
我们知道生物酶制剂对温度有较强的敏感性，所以分别设置20，25，30，35,40，45℃几个时间区间来找到最佳酶解温度。
2.2.2.3摇瓶种子液培养时间对原生质体制备的影响
取活化好的固体斜面培养基，加入5mL无菌水，振荡摇匀，制成孢子悬液备用。
在盛有20mL菌丝体培养基（生长培养基）的50mL三角瓶中，按1:
20的比例用灭菌好的刻度吸管在无菌室内吸取孢子悬液1mL接入三角瓶，置于28℃下摇床振荡培养12h，24h，36h,48h观察液体培养基长出菌丝球状况，找到最适培养时间。
2.2.2.4渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
渗透压稳定剂在不同过程中的效果不同，在没接过程中以蔗糖为渗透压稳定剂的效果好，而在原生质体再生时，则以氯化钾为渗透压稳定剂效果好，由此可见，在不同条件下需要选择不同的渗透压调节剂。
在酶解过程中，蔗糖不仅可以满足渗透压调节作用，同时还有可能对细胞壁降解酶的活性产生一定的影响，而氯化钾渗透压调节剂对原生质体有较稳定的效果，通过对比两种渗透压稳定剂选择效果最好的一种。
毕业论文开题报告
指导教师意见：
1．对“文献综述”的评语：
该同学在参阅了十余篇参考文献的基础上，对两种乳酸菌的主要特性、乳酸菌与中草药的相互作用等内容进行了综述，对本课题的意义有了一定的了解，内容较为全面，为本课题的完成起到了较好的铺垫作用。
2．对本课题的深度、广度及工作量的意见和对设计（论文）结果的预测：
本课题要求在查阅国内外文献的基础上，拟定研究思路、制定试验方案。
要求按“淮阴工学院毕业设计工作条例”完成毕业论文。
课题内容具有一定的深度和广度，工作量适中，预计可以按期完成任务要求。
2015
年
3
月
31
日
指导教师：
所在专业审查意见：
同意
负责人：
2015
年
4
月
5
日
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