应用微卫星标DNA记对三个封闭群兔遗传分析.docx

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应用微卫星标DNA记对三个封闭群兔遗传分析

应用微卫星标DNA记对三个封闭群兔遗传分析

申幸娇，岳秉飞

（中国食品药品检定研究院北京100050）

[摘要]：

目的检测国内日本大耳白兔、青紫蓝兔、新西兰白兔的遗传背景及遗传结构，为封闭群兔遗传检测方法建立和标准化提供基础资料。

方法应用18个微卫星标记及荧光标记-半自动基因分型技术对三个群体95个个体进行Hardy-Weinberg检测，统计每个位点等位基因频率、杂合度、F值、遗传距离等信息。

结果三个种群平均等位基因观测数为3.167、4.556、3.444，平均观测杂合度为0.444、0.5230、0.4976。

18个位点平均多态信息含量（PIC）为0.410、0.549、0.470，日本大耳白兔6个位点HWE检验P﹤0.05，显著偏离Hardy-Weinberg平衡，并在Sat13，INRCCDDV0088位点基因型完全纯和，新西兰白兔和青紫蓝兔分别有2个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。

三个种群遗传距离：

青紫蓝兔与新西兰白兔遗传距离最近，为0.124，与日本大耳白兔遗传关系最远，为0.320；新西兰白兔与日本大耳白兔较远，为0.310。

结论三个种群有各自不同遗传特征，遗传多样性较高，种群间分化明显。

个别位点偏离遗传平衡，推测人工繁育过程中存在一定问题。

[关键词]：

日本大耳白兔；青紫蓝兔；新西兰白兔；封闭群；微卫星

GeneticAnalysisofThreeGroupsofClosedClolonyRabbitsusingMicrosatelliteDNAMarkers

SHENXing-jiao,YUEBing-fei

（NationalInstitutesforFoodandDrugControlBeijing100050）

[Abstract]ObjectiveToanalyzethepopulationgeneticsofthreegroupsofclosedcolonyrabbits：

Japanesewhiterabbits（JWR），Chinchillarabbits（CR），andNewZealandrabbits（NZWR）．Methods18microsatellitelociwereselectedandtestedbyHardy-Weinbergequilibrium（HWE），andthevaluesoftheallelefrequency，observedheterozygosityandexpectedheterozygosity，theF-statisticvalueandthegeneticdistancewerecounted.ResualtsInthreepopulations,theaveragenumberofobservedallelesrespectivelyare3.167、4.556、3.444;Theaverageobservedheterozygosityrespectivelyare0.444、0.5230、0.4976;Theaveragepolymorphisminformationcontent（PIC）respectivelyare0.410、0.549、0.470.FourlocishowedevidentdeviationfromthatoftheHWE（P<0.05）andtwolociofSat13andINRCCDDV0088arecompletelyhomozygousinJWRpopulation;TherearetwolocievidentdeviationfromHWEinCRandNZW.ThegeneticdistanceofCRandNZWis0.124,whilethatofCRandJWRbeing0.320andJWRandCRbeing0.310.ConclusionsThreepopulationshavedifferentgeneticcharacteristics,whosegeneticdiversityarerelativelyrich.SeverallociareevidentdeviationfromthatoftheHWE,whichprobablyindicatesthatcertainproblemsexistintheprocessofartificialbreeding.

[keywords]Japanesewhiterabbit;Chinchillarabbit;NewZealandrabbit;closedcolonyanimal;MicrosatelliteDNA

家兔是最早用于实验的动物之一，在医学科学研究领域里发挥独特的作用。

目前，最常用的实验兔为封闭群兔。

封闭群动物是群体概念，遗传组成复杂，尚缺乏统一的遗传监测标准和方法。

对于封闭群动物的遗传性状控制主要针对两个方面[1]：

（1）在群体内保持其个体间较大的遗传性状差异；

（2）所有基因的相对频率保持稳定。

然而，国内实验兔遗传质量尚不稳定，主要是在繁育环节上进行质量控制。

遗传背景不清，会造成实验结果偏差较大，直接影响了生命科学的研究水平，遗传检测方法有待建立[2]。

微卫星DNA是指以1-6bp核苷酸为单位的多次串联重复序列，长度一般在300bp以下，又称短片段串联重复（ShortTandemRepeatsSTR），简单重复序列（SingleSequenceRepeatsSSR）。

STR标记是共显性遗传，分布广、多态性丰富、稳定性高。

同时，微卫星标记带型简单、重复性好、易操作。

被认为是在各种遗传标记中最有价值的一种[3]。

本文利用18个微卫星标记及荧光标记-半自动基因分型技术开展封闭群兔遗传多样性研究，以提供更多背景资料，为实验兔遗传检测方法建立，遗传质量控制和标准化奠定基础。

1材料与方法

1.1实验动物

本实验样本来自北京地区三家单位，SPF级日本大耳白兔28只[SCXK（京）2010-0002]，SPF级新西兰白兔29只[SCXK（京）2009-0017]，SPF级青紫蓝兔38只[SCXK（京）2009-0010]，所有动物在生产群中随机抽取。

耳缘静脉采血，共95份样品，4℃保存。

1.2血液基因组DNA提取

参照《分子克隆实验指南》[4]及LoparevVN等[5]方案，NaI法提取抗凝血基因组DNA。

1.3引物选择及筛选

参考相关文献[6-10]，对47个微卫星位点进行筛选，详情见表1。

最终得到出18个微卫星位点进行群体遗传学分析，引物详情见表2，普通引物和荧光引物均由上海生工生物工程股份公司合成。

表1初步筛选的47个微卫星位点

Tab.1Thepreliminarilyselected47microsatellitcloci

位点

Loci

序列号

Genbank

位点

Loci

序列号

Genbank

位点

Loci

序列号

Genbank

Sat2

M77195

INRCCDDV0016

AJ874380

2L1E11

AF421941

Sat5

X99887

INRCCDDV0087

AJ874430

12L4A1

AF421945

Sat8

X99889

INRCCDDV0203

AJ874540

Sat4

M33582

INRCCDDV0088

AJ874431

MHC-Iantigen-like

Loc100349247

MHC-ⅡDR-β

Loc100350168

Sol33

X94683

INRCCDDV0176

AJ874514

Sat16

X99890

Sol44

X94684

INRCCDDV0057

AJ874404

7L1F1

AF421930

19L1G5

AF421952

INRCCDDV0055

AJ874403

6L3F8

AF421924

6L1F10

AF421916

INRCCDDV0318

AJ874638

7L1D3

AF421928

INRCCDDV0201

AJ874538

INRCCDDV0033

AJ874369

INRCCDDV0347

AJ874664

INRCCDDV2016

AJ874550

INRCCDDV0165

AJ874505

12L5A6

AF421947

INRCCDDV0344

AJ874660

RLA-ⅡQregion

Loc100354611

INRCCDDV0203

AJ874369

6L2H3

AF421920

INRCCDDV0013

AJ874377

19L1A4

AF421984

7L1B10

AF421926

INRCCDDV0093

AJ874436

6L3B4

AF421922

7L3F2

AF421933

INRCCDDV0098

AJ874440

Sat12

X99891

Sat7

X99888

INRCCDDV0213

AJ874547

12L1C2

AF421939

Sat13

X99892

INRCCDDV0328

AJ874646

1.4PCR扩增

25μL反应体系：

引物（10pmol/μL），0.5μL；Tag酶（2.5U/μL），0.2μL；dNTP（2mM），2.0μL；10×PCRbuffer（Mg2+），1.5μL；模板（10-50ng/μL）,10μL；ddH20，18.3μL。

PCR扩增条件：

95℃预变性4min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。

Taq酶和dNTP均购大连宝生物工程有限公司。

1.5等位基因分离

3%琼脂糖凝胶电泳分离产物，5’-FAM单色荧光标记引物进行STR扫描，获得每个样品18个位点的基因片段大小。

1.6数据分析

PopGen1.32软件分析如下参数：

各位点观测等位基因数、有效等位基因数、等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、群内近交系数（FIS）、群间遗传分化系数（FST）、遗传相似度与遗传距离；在线软件GenePop对各位点进行种群内Hardy-Weinberg平衡及杂合子缺失检测；Cervus2.0软件对每个位点进行多态信息含量（PIC）分析。

表218个微卫星位点详情

Tab.2Theinformationof18microsatellitcloci

位点

Loci

序列号

GenbankNo

等位基因数

AlleleNumber

退火温度Tm/℃

引物

PrimerSequence（5’→3’）

Sat2

M77195

8

55

GCTCTCCTTTGGCATACTCC

GCTTTGGATAGGCCCAGATC

Sat5

X99887

5

60

GCTTCTGGCTTCAACCTGAC

CTTAGGGTGCAGAATTATAAGAG

Sat8

X99889

5

60

CAGACCCGGCAGTTGCAGAG

GGGAGAGAGGGATGGAGGTATG

Sat12

X99891

4

55

CTTGAGTTTTAAATTCGGGC

GTTTGGATGCTATCTCAGTCC

Sol33

X94683

5

55

GAAGGCTCTGAGATCTAGAT

GGGCCAATAGGTACTGATCCATGT

Sol44

X94684

5

60

GGCCCTAGTCTGACTCTGATTG

GGTGGGGCGGCGGGTCTGAAAC

INRCCDDV0203

AJ874369

5

56

GATCCAGTCATGGTGTGTGTG

TAGGGCTGGGTTTTTATCTGG

6L1F10

AF421916

5

60

GTCTTTGGCAGGCTTACTT

AGACAATAGCAAAAGAAGGC

INRCCDDV0201

AJ874538

5

59

TCCTAACCACCAAGCAATG

TGGGGAAGTAACCAGTAGATGAA

INRCCDDV2016

AJ874550

12

60

TCTGCCAAGTGCCCAGTCCTA

AACTCCCGTTTCTTCACTCCCA

INRCCDDV0344

AJ874660

11

60

GAGGAATCTGCACCACCAAGA

AAGGTGGGTGGCTATGTTCAG

6L2H3

AF421920

4

57

CAGTGGAATGGAGGGAAGA

ATTTGAGTAGTGAGCCATCAGA

7L1B10

AF421926

5

53

GCAGGAAGAAAAGGAAGATT

TGTCATAAGCATTTGGGAAG

7L3F2

AF421933

4

57

GCATTTAGGGAGTGAACCAG

GGTAGAGAAAGGGAGACGG

Sat7

X99888

3

60

GTAACCACCCATGCACACTC

GCACAATACCTGGGATGTAG

Sat13

X99892

3

55

CAGTTTTGAAGGACACCTGC

GCCTCTACCTTTGTGGGG

INRCCDDV0088

AJ874431

3

50

GTCATCTGCCCATAAAC

AATAACACGCCTACCTT

19L1A4

AF421984

3

53

CTAAGCCTTTAAAAACTTGC

CACTTGATTGGATGATGACA

2结果

2.1等位基因频率及遗传变异分析

等位基因频率分析结果见表3。

每个位点等位基因数3~12个，共检测出56个等位基因。

日本大耳白兔、青紫蓝兔、新西兰白兔平均等位基因数分别为3.167、4.556、3.444；平均有效等位基因数分别为2.187、2.704、2.359；特有等位基因数分别为：

6、11、7。

日本大耳白兔在Sat13位点和INRCCDDV0088位点上完全纯合。

表3三个封闭群兔18个微卫星位点等位基因频率

Tab.3Allelefrequenciesof18microsatellitelociinthreeclosedcolonygroupsofrabbits

位点

loci

基因大小

Allele（bp）

等位基因频率

Allelefrequency

位点

loci

等位基因

Allele（bp）

等位基因频率

Allelefrequency

大耳白兔

JWR

青紫蓝兔

CR

新西兰兔

NWR

大耳白兔

JWR

青紫蓝兔

CR

新西兰兔

NWR

Sat2

237

0

0.0312

0

INRCCDDV0088

324

0

0

0.0690

239

0.1429

0.1719

0.4310

328

0

0.2241

0.1552

241

0

0.1562

0

330

1.0000

0.7759

0.7759

245

0.0357

0.0469

0

INRCCDDV0201

314

0

0.3382

0.0862

247

0.8036

0.2656

0.3103

318

0.3929

0.0294

0.3621

249

0

0.0469

0.1724

324

0.1607

0.3382

0.5345

251

0.0179

0.2031

0.0862

326

0.4464

0.1765

0.0172

253

0

0.0781

0

328

0

0.0147

0

Sat5

210

0.5357

0.1571

0.1034

INRCCDDV2016

291

0.2679

0

0

227

0

0.0286

0

300

0.1607

0.2568

0.2241

229

0.4643

0.6857

0.8793

302

0

0.0541

0

231

0

0.0857

0.0172

303

0

0

0.0345

235

0

0.0429

0

306

0.3571

0.1622

0.2931

Sat7

183

0.9286

0.7059

0.6379

307

0.0357

0.3243

0.2759

191

0.0714

0.1912

0.3621

310

0

0.0946

0

193

0

0.1029

0

311

0.1429

0.0541

0

Sat8

134

0.7857

0.4605

0.7069

312

0.0357

0.0135

0

135

0

0.0789

0

315

0

0.0270

0

138

0.1250

0.1316

0

317

0

0

0.0172

139

0.0357

0.1447

0

318

0

0.0135

0.1552

156

0.0536

0.1842

0.2931

INRCCDDV0344

260

0.0536

0.2237

0.0167

Sat12

120

0.1964

0.0135

0.0357

262

0.0357

0.1579

0

124

0.0893

0.0811

0

266

0.3214

0.0132

0

128

0.5893

0.7432

0.6607

268

0

0.1842

0.3393

132

0.1250

0.1622

0.3036

272

0

0.0526

0.2679

Sat13

111

0

0.0147

0

274

0

0.0921

0.1786

113

0

0.0588

0.2069

276

0.0893

0.1447

0

125

1.0000

0.9625

0.7931

278

0.3750

0.0921

0

So133

208

0.3571

0.1486

0.2931

280

0.1250

0

0

210

0.2679

0

0

282

0

0.0132

0.0536

212

0

0.0811

0.0345

264

0

0.0263

0

214

0.2321

0.7703

0.0624

6L2H3

242

0.2222

0.1857

0.0345

220

0.1429

0

0

247

0

0

0.2069

So144

203

0.0179

0

0

250

0.1481

0.4000

0.1034

205

0.2500

0.0676

0.0517

251

0.6296

0.4143

0.6552

207

0.4286

0

0

7L1B10

178

0.3571

0.1486

0.1724

209

0.2321

0.5405

0.5172

180

0

0.0946

0

211

0.0714

0.3919

0.4310

181

0

0.6622

0.6207

INRCCDDV0203

184

0

0.7500

0.1379

183

0

0.0405

0.0269

186

0.0357

0

0.0345

184

0.6429

0.0541

0

188

0.2857

0.0132

0.3276

7L3F2

135

0.3036

0.1944

0.1724

192

0.6786

0.2368

0.3448

140

0.6964

0.7639

0.7414

194

0

0

0.1552

142

0

0.417

0.0690

6L1F10

234

0.3333

0.0135

0.0690

145

0

0

0.0172

236

0

0.0270

0.1552

19L1A4

226

0.5000

0.2162

0.3036

238

0

0.4054

0.7759

232

0.4821

0.5405

0.6964

240

0

0.1216

0

234

0.0179

0.2432

0

244

0.6667

0.4324

0

表4三个种群杂合度、多态信息含量及Hardy-Weinberg平衡检测P值

Tab．4Theheterozygosity,PICandHWEtestof18mierosatellitelociinthreeclosedcolonygroupsofrabbits

日本大耳白兔

JWR

青紫蓝兔

CR

新西兰白兔

NZW

locus

P（HWE）

PIC

Ho

He

P（HWE）

PIC

Ho

He

P（HWE）

PIC

Ho

He

Sat2

0.0162

0.304

0.2143

0.3383

0.4751

0.831

0.5405

0.6101

0.6831

0.624

0.4643

0.6927

Sat5

1

0.374

0.500

0.5065

0.5111

0.536

0.5714

0.5023

1

0.199

0.2414

0.2196

Sat8

0.0713

0.338

0.3571

0.3695

0.0021

0.672

0.5789

0.7189

0.6595

0.329

0.3793

0.4217

Sat12

0.5095

0.545

0.7143

0.6013

0.2417

0.41

0.4054

0.4202

1

0.432

0.4643

0.4786

So133

0.6652

0.676

0.8214

0.7396

0.