pcr技术发展与展望.docx

pcr技术发展与展望.docx

《pcr技术发展与展望.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《pcr技术发展与展望.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

pcr技术发展与展望

pcr技术发展与展望

PCR技术的发展及展望

摘要：

PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来．基于常规PCR技术开发出了许多新的用途。

综述了PCR技术的主要扩展。

关键词：

PCR技术

1971年Khorana等最早提出PCR理论：

“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。

因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。

1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。

以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。

通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。

最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。

它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断[1]。

到目前为止，PCR技术已有十几种之多。

本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。

1.PCR技术的扩展

1.1AP-PCR技术

1.1.1AP-PCR技术的定义、来源及特点

AP-PCR（ArbitrarilyprimedPCR）技术[2]，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下．主

是指先将细胞和组织进行处理（网定、酶消化）．以获得适度的细胞通透性；再通过逆转录使mRNA转录成cDNA；然后把载玻片放人热循环机，对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行PCR扩增（扩增反应中含有标记的单核苷酸）；最后通过检测标记产物的方法检测扩增产物[13]。

1.4.2原位PCR技术与原位反转录PCR技术的比较

原位PCR技术在进一步提高以单细胞底物进行PGD（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）的效率的前提下，由Thornhill[14]提出．它具有细胞定位能力和高度特异敏感。

原位反转录PCR技术是原位PCR技术的一种，它检测的靶序列为RNA，由Nuovo等[15]1992年发明。

具有操作简单、流程短、省时等优点；同时具有特异性差、容易出现非特异性DNA产物、造成假阳性、且扩增效率较低．特别是石蜡切片[16]等缺点。

1.4.3原位PCR技术与原位反转录PCR技术的应用

原位PCR技术是常规PCR在细胞学领域的扩展，它常被用于感染性外源基因的检测、内源基因的检测与导入基因的检测等．如对HIV、结核杆菌等进行的检测[17]。

原位反转录PCR技术常被用于扩增和检测标本中罕见的mRNA，如定量细胞表达特殊mRNA的丰度、检测扩增产物的细胞起源及检测细胞群中基因表达的趋势等[18]

1.5定量PCR技术

1.5.1定量PCR技术的定义及特点

定量PCR（polymeraseChainReaction）技术有广义和狭义两层含义。

广义的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。

狭义的定量PCR技术．又称为实时荧光定量PCR技术（real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）．它是严格意义上的定量PCR技术，指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的．同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零），1996年南美国AppliedBiosystems公司推出．与常规PCR技术相比．定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量．同时具有灵敏度更高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[19]。

1.5.2定量PCR技术的应用

定量PCR技术实现了PCR技术从定性分析到定量测定的发展，它常被应用于临床微生物、食品微生物、临床肿瘤学的检测、肿瘤耐药基因表达的研究、细胞因子的表达分析等方面。

其中，临床微生物和食品微生物是定量PCR应用中最重要的两个方面，彭年才等[19]2010年自主研发了用于食品安全检测的实时定量PCR仪，并已投入产业化应用。

1.6多重PCR技术

1.6.1多重PCR技术的定义及特点

多重PCR（multiplexPCR）是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，它最明显的优点是省时、省力、能够快速检测和鉴别病原体[20]，另外，多重PCR还可以精确地估计一个样品中模板数量。

1.6.2多重PCR技术的应用

多重PCR技术将多个PCR反应放在同一个体系内，进一步提高了PCR反应的效率，它被广泛地用于病原体鉴别、性别鉴定、连锁分析、法医研究、模板检测和基因的疾病诊断等方面。

1.7反向PCR技术

1.7.1反向PCR技术的定义及特点

反向PCR（reversePCR），又称为染色体缓移（chrornosmewalking）[22]，它是指利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增．得到已知序列的旁侧DNA片段。

与常规PCR技术相比．反向PCR优势突出，但它需要从许多酶中选择限制酶．或者说必须选择一种合适的酶进行酶切．另外，由于大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有时也会存在这些序列．从而导致反向PCR得到的探针与多个基因序列杂交，影响扩增效果。

1.7.2反向PCR技术的应用

反向PCR技术在检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件等方面较常规PCR技术优势明显[22]，Souer等1995年将反向PCR技术与差别筛选法相结合，从矮牵牛W138中分离得到了高效转座子标签dTphl标记的基因。

1.8锚定PCR技术

1.8.1锚定PcR技术的定义及特点

锚定PCR（AnchoredPCR）[23]，又称同定PCR．它以基因组总DNA为模板，用一条基因特异性引物进行线性PCR扩增，产生单链扩增产物；在末端转移酶的作用下，在单链DNA分子的3’末端加上多聚胞嘧啶；用巢式基因特异性引物与多聚胞嘧啶配对的锚定引物对加尾的产物进行PCR扩增．PCR产物连入载体后进行测序鉴定。

与常规PCR技术相比。

锚定PCR技术特异性高、有较长的步行距离，一次实验可以获得1．5kb左右的目的片段，同时它无需对基因组总DNA进行限制性内切酶消化段连接反应，另外．其操作过程较其他方法简单，大约2-3个工作日就能完成。

1.8.2锚定PCR技术的应用

锚定PCR技术解决了常规PCR技术所不能完成的已知片段侧翼序列的克隆问题，是常规PCR技术的又一重大扩展。

1.9兼并引物PCR技术

1.9.1兼并引物PCR技术的定义

兼并引物PCR（degenerateprimerPCR）是指针对由密码子的兼并性引起的。

单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列的不精确性，设计成对兼并引物。

通过PCR扩增所有编码已知顺序的核酸序列。

1.9.2兼并引物PCR技术的应用

兼并引物PCR技术是常规PCR技术在蛋白领域的应用，具体表现在两个方面：

（1）寻找新蛋白已被测定的一段氨基酸序列的相应基因；

（2）寻找其有进化上保守结构域的蛋白质家族新成员的基因[25].陶爱林等[26]采用该技术成功进行了蓰草花粉过敏原全长同源基因的克隆。

1.10重组PCR技术及其应用

1.10.1重组PCR技术的定义

重组PCR（recombinantPCR）是通过DNA重叠序列的衔接作用。

使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术[27]。

它包括三个阶段：

（1）制备用于重组的DNA组件；

（2）组件分子作为引物互为模板延伸；（3）克隆和定向筛选重组产物[28]。

1.10.2重组PCR技术的应用

重组PCR技术的出现，使常规PCR技术得到进一步扩展，它是PCR技术在核酸与蛋白两个领域应用的结晶。

重组PCR技术的应用主要表现在：

（1）精确解析大分子功能和相互作用的结构基础，如标定活性位点的关键残基、确认已知蛋白中未知功能的结构域、揭示配体一受体识别过程中相互临近的区域等。

（2）探索顺式作用元件的调控机理，揭示mRNA的非翻译区的功能、确定启动子和增强子成分的功能等。

（3）嵌合受体在研究信号途径和胞内定位中具有独特的“钓鱼”优势，用功能已知的分子和待研究对象嵌合来研究结合TGF之后的TGFR二聚化形式和内向整流型钾通道的脂筏定位过程[29,30]，（4）开发新型载体，比如通过DNA重排来增强绿色荧光蛋白（GFP）的荧光稳定性；（5）升级分子标记，通过DNA改组已经获得的重组拟南芥K+转运蛋白可以使植株内的钾离子富集度提高26．1％；（6）重组PCR在蛋白体外定向进化中的的应用最引人瞩目；（7）基于重组PCR技术的分子育种（molecularbreeding）在疫苗研发中有着广阔的应用前景．以HIV病毒疫苗研制为例，2002年运用DNAshufling技术突破了HIV的宿主专一性，得到了高复制率的嵌合猿-人免疫缺陷病毒（SHIV）[24]。

2.展望

PCR作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与分子生物学的发展．而目．在其它领域科学家的努力与创新下。

其不断与该领域的核心技术相结合，极大地推动了此领域的发展。

另外，PCR技术从问世便成为生物学界的一大热点，它在烟草领域的应用由来已久，它的出现对烟草领域的研究者们造成了极显著的影响．同时也极大地促进了烟草领域的研究。

总之．随着科学技术的不断进步．PCR技术必将得到新的发展，以之为基础的新技术将不断出现，它在烟草领域研究中的作用亦日渐明显。

参考文献：

[1]黄留玉．PCR最新技术原理、方法及应用[M]．北京：

化学工业出版社．2005．

[2]孟祥文，李璞．AP-PCR技术及其应用[J]．国外医学遗传学分册．1995．18（3）：

117-120．

[3]杨国玲,孙晓岩,李文利,等．AP-PCR快速鉴定甲真菌病病原菌的研究[J]．真菌学杂志．2007．2

（2）：

89-91．

[4]陈尚武．不同种类的PCR技术及其应用[J]．贵阳医学院校报．1993．14（3）：

113一l16．

[5]FindlayI,QuirkeP．HallJ．F1uorescentPCR：

anewtechniqueforPGDofsexandsinglegenedefcts[J].JAssistReprodGenet,1996．13

（2）：

96．

[6]sanoT．CasandraL，SmithCI,etal．ImmunoPCR：

VersensitiveantigendetectionbymeansofspecificantibodyDNAconjugate[J]．Science．1992．258：

120-122．

[7]黄杰．免疫PCR技术及其应用研究进展[J]．国际检验医学杂志。

2006．27（8）：

709—712．

[8]FuruyaD．YagihashiA．YajimaT．eta1．Animmuno-polymerasechainreactionassayforhumaninterleukin-18[J].JImmunolMethods．2000，238（1—2）：

173一180．

[9]HuangSH，ChangTC．DetectionofStaphylococcusaureusbyasensitiveimmuno-PCRassay[J]．ClinChem，2004．50（9）：

1673一1674．

[10]MonteiroI。

GrasN．MegraudF．Magneticimmuno-PCRassaywithinhibitorremovalfordirectdetectionofHelicobacterpyloriinhumanfaces[J]．JClinMicrobio1．2001．39（10）：

3778—3780．

[11]宋云扬，吴方晖．张靖．等．夹心免疫PCR方法检测金葡菌肠毒素B[J]．中国公共卫生．2004，20（7）：

832—833．

[12]李雪梅．程安春．汪铭书．原位反转录PcR技术的应用[J]．中国兽医科技，20Q5．35（3）：

239—243．

[13]ChenRH.FuggleSV．InsitucDNApolymerasechainreaction：

rescearchandclinical[A]．In：

KirkamN.ProgrameinPathology．Val2[C]．LondonUK：

ChurchillLivingstone,1995.203—218．

[14]VeigaA．BoadaM，BarriPN．Preimplsntstiongeneticdiagnosis：

indicationstechniquesandresults[J]．ContraceptFertilsex，1998,26（4）：

568．

[15]NuovoGJ，GorgoneG。

MacConnellP．eta1．InsituLocalizationofhumanandviralcDNAsafterPCRAmplification[J]．PCRMethodsAppl，1992，

（2）：

117-123．

[16]LongAA．KomminnothP。

LeeE，eta1．ComparisonofIndirectanddirectinsitupolymerasechainreactionincellPreparationstissuesections[J]．Histochemistry．1993．99

（2）：

151一162．

[17]邵军军．常惠芸，谢庆阁．原位PCR技术及其应用[J]．中国兽医科学与技术．2003．33（6）：

32—35．

[18]谢辉．章伟文．陈宏。

等．原位反转录PCR技术及其应用的研究进展[J]．医学理论与实践，2003。

16（4）：

402—403．

[19]彭年才．牵明．苗宝刖．用于食品微生物快速检测的实时定量PCR仪及ATP仪的研制和应用．20l0年第三届国际食品安全高峰论坛硷立集．2010：

20-22．

[20]赵敏．多基因PCR及其应用[J]．国外医学流行病学传染宿学分册．1995．22（6）：

270-272．

[21]高玉龙．焦芳婵．徐照丽．等．多重PCR在烟草转基因检测中的应用[J]．生物技术通报，2008．

（2）：

140-142．

[22]李竹红，刘德培．梁植权．改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列[J]．生物化学与生物物理进展．1999。

26（6）：

60．

[23]陈柏君．孙超．王勇．等．锚定PCR（AnchoredPCR）：

一种新的染色体步行方法[J]．科学通报．2004．49（15）：

1569-1571．

[24]贾小平，王天字．黎裕．等．用锚定PCR技术筛选谷子微卫星文库的研究[J]．吉林农业大学学报．2009.3l（4）：

364—367，372．

[25]王洪振，周晓馥，宋朝霞．等．简并PCR技术及其在基因克隆中的应用[J]．技术与方法．2002。

25

（2）：

20l一204．

[26]陶爱林．何韶衡．张利达，等．采用兼并引物与Touchdown梯度PCR克隆蓰草花粉过敏原余长同源基因[J]．生命科学研究．2004．

（1）：

180-185．

[27]赵品军．朱咸艳。

刘祥．等．重组PCR技术的应用及优化[J]．激光生物学报．2008．17（3）：

355—362．

[28]王皓．康现江。

王琦．重组PCR技术研究进展和应用[J]．中国生物工程杂志．2007．27（5）：

153-156．

[29]AmiearRA．LoefEB．Chimericgranulocyte/macrophageColony-stimulatingfactor/transforminggrowthfactor-brta（TGF-beta）receptorsdefineamodel,systemforinvestigatingtheroleofhomomericandheteromericreceptorsinTGF—betasignaling[J]．JBiolChemm，l996．271（36）：

21758—21766．

[30]DellingM,WischmeyerE,DiytatevA．etal．Theneuralcell.Adhesionmoleculeregulatescell-surfacedeliveryofG-protein-activatedinwardlyrectifyingpotassiumchannelsvialipidrafts[J].JNeuorsci，2002．22（16）：

7154-7164．