核桃蛋白肽的运用研究.docx
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核桃蛋白肽的运用研究
西南林学院
本科毕业（设计）论文
（2010届）
题目核桃蛋白肽在果酒和运动饮料中的应用研究
（2）
教学院系资源学院专业食品科学与工程
学生姓名杨有金
指导教师范方宇（讲师）
评阅人
2010年1月12日
核桃蛋白肽在果酒及运动饮料中的应用研究
（2）
杨有金
（西南林学院资源学院，云南昆明650224）
摘要：
本研究采用碱溶酸沉法提取核桃蛋白质，中性蛋白酶水解。
结果表明核桃蛋白质最佳提取条件为:
采用超声波处理，pH为7.5、温度为55℃，固液比为1：
90，时间为70min，提取，其提取率为55.83%；中性蛋白酶酶解条件为：
温度55℃、底物浓度5%、酶和底物浓度之比为500U/g、酶解时间为1小时。
用本法制备的核桃蛋白肽研究核桃蛋白肽发酵酒与核桃蛋白肽运动饮料。
其中，核桃与葡萄经发酵、调配等过程制备出口感和风味较适宜的核桃蛋白肽葡萄发酵酒。
核桃蛋白肽运动饮料的最佳配方为：
蛋白肽与水比例1:
5（V/V）、蔗糖量6%、柠檬酸量0.15%、氯化钠量0.1%，并在115℃条件下，灭菌10～15min，在此条件制得的饮料风味较好。
关键词：
核桃蛋白；核桃蛋白肽；发酵；调配
Walnutproteinpeptideintheapplicationofwineandsportsdrink
（2）
YangYoujin
（SouthwestForestryCollege,InstituteofResources,Kunming,Yunnan650224）
Abstract:
Thispaperusethealkali-solubletodistillacid-extractedprotein,neutralproteasehydrolyzedproteinwalnut.Theresultsshowedthattheoptimalconditionsoftheproteinoptimumextractionwere:
ultrasonicconditions,pH7.5,temperature55℃,70min,thesolid-liquidratiooneninety,theextractionrate55.83%.Thehydrolysisconditionsofneutralproteaseenzymaticwere:
temperature55℃,substrateconcentration5%,enzymeandsubstrateconcentrationratio500U/g,hydrolysistime1hour.Walnutproteinpeptidepreparedbythelawstudywalnutproteinpeptidefermentingwineandwalnutproteinpeptidesportsdrink.Withwalnutsandgrapesfermentedandprepared,wecanproduceawalnutproteinpeptidefermentingwinewhichisfullwithcomfortablemouthfeelandaspecialflavor.ThebestformulaoftheWalnutproteinpeptidesportsdrinkswere:
Theratioofproteinpeptideandwateris1:
5（V/V）,theamountof6%sucrose,citricacidamountof0.15%,theamountof0.1%sodiumchloride,thedrinktastegoodundertheconditionof115℃,Sterilization10~15min.
Keywords:
walnutprotein;walnutproteinpeptide;fermentation;deployment
目录
1前言1
1.1核桃的概述1
1.2核桃的营养价值1
1.2.1核桃仁的营养成分1
1.2.2核桃仁的氨基酸1
1.2.3核桃仁的必需氨基酸2
1.2.4核桃仁的脂肪酸2
1.3核桃蛋白的营养价值2
1.4核桃蛋白的开发现状与前景3
1.4.1核桃蛋白的开发现状3
1.4.2核桃蛋白的开发前景3
1.5肽的基本概述4
1.6核桃蛋白肽的化学组成4
1.7核桃蛋白肽的应用4
1.8研究的目的及意义5
1.9研究的主要内容及预期目标5
1.9.1研究内容5
1.9.2预期目标6
2核桃蛋白肽的制备7
2.1引言7
2.2材料与设备7
2.2.1材料与试剂7
2.2.2设备7
2.3方法7
2.3.1工艺流程7
2.3.2核桃仁脱皮8
2.3.3除油8
2.3.4核桃蛋白提取条件的优化8
2.3.5喷雾干燥9
2.3.6核桃蛋白质的酶解9
2.4结果9
2.4.1各种辅助方法的比较9
2.4.2核桃蛋白提取正交试验9
2.4.3核桃蛋白酶解条件11
3核桃蛋白肽葡萄发酵酒的研制12
3.1引言12
3.2材料与设备12
3.2.1材料与试剂12
3.2.2设备12
3.3方法12
3.3.1工艺流程12
3.3.2操作步骤12
3.3.3理化指标测定13
3.4结果18
4核桃蛋白肽运动饮料的研制19
4.1引言19
4.2材料与设备19
4.2.1材料与试剂19
4.2.2设备19
4.3方法19
4.3.1工艺流程19
4.3.2核桃蛋白肽运动饮料调配条件的优化19
4.4结果20
4.5结论22
参考文献23
指导老师简介24
致谢25
1前言
1.1核桃的概述
核桃为落叶乔木胡桃的坚果，原产古波斯。
晋·张华在《博物志》中载“汉时张蓦出使西域，始得种还，植于秦中，渐及中土”，证明我国的核桃栽培历史悠久。
我国核桃种质资源十分丰富,据《中国果树志》核桃卷载,有无性系品种和优良品种216个，农家实生良种164个，优良单株系486个。
平均每公顷核桃产量为260kg。
云南的大泡核桃又名漾滇核桃、山西香玲核桃、河北的石门核桃、四川露仁核桃、新疆纸皮核桃、陕西秦岭一带的“鸡蛋皮核桃”、临安山核桃等，均为我国特有的核桃资源。
核桃含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素，核桃脂肪中的磷脂具有补脑健脑作用。
《本草纲目》载核桃能“令人肥健，润肌，黑须发，利小便，去五痔”。
对核桃进行深加工及综合利用，开发各种营养保健食品，具有重要的经济价值和生态效益。
1.2核桃的营养价值
1.2.1核桃仁的营养成分[1]
表1核桃仁的营养成分
成分粗蛋白脂肪灰分粗纤维碳水化合物
％18.268.51.34.27.3
1.2.2核桃仁的氨基酸[2]
表2核桃仁的氨基酸含量（g/100g）
名称天冬氨酸苏氨酸丝氨酸谷氨酸脯氨酸甘氨酸丙氨酸
含量％1.7460.5930.8233.7560.5210.8830.767
名称胱氨酸缬氨酸甲硫氨酸异亮氨酸亮氨酸络氨酸
含量％0.3030.9050.2980.7361.3540.652
名称苯丙氨酸组氨酸赖氨酸精氨酸色氨酸必需氨基酸总量
含量％0.8390.4740.6032.9500.15213.5927.35
从表2可看出：
核桃仁18种氨基酸齐全，而且对人体生理有重要功能的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量均较高。
1.2.3核桃仁的必需氨基酸[2]
表3必需氨基酸与FAO/WHO模式比较与评价（mg/g蛋白质）
名称异亮氨酸亮氨酸缬氨酸赖氨酸蛋氨酸苯丙氨酸苏氨酸色氨酸
含量39.5670.9047.4031.6017.3064.9533.528.35
FAO/WHO4070505535604010
评价分98.9101.394.857.549.4102.583.883.5
从表3可看出：
人体所需的8中必须氨基酸含量合理，接近FAO/WHO规定的标准，故核桃蛋白是一种良好的蛋白源。
1.2.4核桃仁的脂肪酸[1]
表4核桃油与其他食用油脂肪酸组成对照（％）
名称棕榈酸硬脂酸油酸亚油酸亚麻酸花生四烯酸
菜籽油3.51.120.311.47.310.4
米糠油12.32.349.728.86.9
花生油11.64.838.642
棉籽油31.61.813.748.53.8
玉米油11.434.853.8
大豆油13.52.221.154.5
葵花籽油7.43.223.266.2
红花油7.32.615.574.5
核桃油5.72.719.762.99.20.3
从表4可看出：
核桃仁中总不饱和脂肪酸占总脂肪酸的91.6％，其中不饱和脂肪酸以多不饱和脂肪酸亚油酸为主，与其他食用油相比，核桃油含有较高比例的不饱和脂肪酸。
1.3核桃蛋白的营养价值
核桃仁含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和微量元素等。
核桃仁的蛋白质含量为14%～17%，可消化率达87.2%。
现代医学证明，核桃对各种不同年龄的人均有医疗保健作用，因此，核桃是一种对人体有补气养血、温肠补肾、止咳润肺、乌发健脑作用的优良干果仁食物。
1.4核桃蛋白的开发现状与前景
根据对核桃仁成分的分析，核桃中除油脂占到65%-70%外，核桃蛋白质含量占到14%-17%，其可消化率达85%，是一种良好的蛋白源。
核桃蛋白质还含有18种氨基酸,除含有人体必需的8种氨基酸外，精氨酸和谷氨酸的含量也比较高[12]。
我国的核桃资源非常丰富，目前市面上的核桃蛋白产品多是核桃粉、核桃乳等，品种少，档次低，开发利用程度和深度远远不够，仅局限于初级食品的制作，产品附加值太低。
只有对核桃进行深加工，开发具有高技术含量的产品，才能让这种宝贵的资源带来更大的利益[3]。
1.4.1核桃蛋白的开发现状
核桃粉目前有关加工制作核桃粉的研究也比较多。
其主要工艺流程为:
核桃仁→挑选→去皮→两次磨浆分乳→均质→杀菌→浓缩→喷粉→包装→成品[4]。
核桃乳核桃乳是人们喜爱的营养型饮料，是蛋白质、维生素B、尼克酸以及多种微量元素的良好来源，并且具有浓郁的核桃香味。
与其他饮料相比，核桃乳对钙、铁吸收不良者有较好的食疗效果，对婴幼儿、青少年、老年人尤为适用。
正常人经常食用，对增强体质，抵抗疾病也有很好的效果。
其工艺流程为:
原料→清洗→浸泡→去皮→磨浆→胶体磨→离心过滤→调浆→均质→真空脱气→灌装→杀菌→冷却→成品。
核桃小食品市场上成熟的核桃蛋白产品还有食用方便的小食品，比如核桃仁的初级加工产品琥珀桃仁，主要配料为糖、蜂蜜、植物油。
加工工艺分为选料漂洗预煮、脱涩冷却甩水套糖油炸甩油吹凉挑选装罐封口入库。
因其香、酥、脆、甜、美味可口,受到大多数消费者的青睐。
在核桃产区,琥珀桃仁成为主要的加工产品。
还有椒盐核桃，其加工方法简单，分为初炒、浸盐、再炒和冷却几个过程。
1.4.2核桃蛋白的开发前景
核桃蛋白核桃蛋白在一定条件下还表现出比较好的起泡性、泡沫稳定性以及持水性说明核桃蛋白具有一定的加工功能性，在添加剂等方面有应用前景，故核桃蛋白是一种良好的蛋白资源。
可以在高纯度核桃蛋白粉、核桃多肽、核桃酱、核桃菜肴等方面进行研究。
1.5肽的基本概述
所有生物的蛋白质都是由20种蛋白质氨基酸组成，氨基酸彼此以肽胺键（也称肽键）相互连接成为“肽”，它们与氨基酸一起构成了千姿百态的蛋白质世界。
一般少于10个氨基酸的肽被称为寡肽，超过10个氨基酸的称为多肽，但两者术语的介定并不严格。
氨基酸为50多个以上的多肽称为蛋白质。
多肽和蛋白质只有肽链长短之别，二者间没有严格区分（齐威等，2001）。
肽具有许多独特的理化特性与生物活性，如起泡性、粘度、胶凝性、乳化性等功能。
随着新型加工技术的应用及人们对“肽”的认识进一步加深，肽的研究成为近十年来的热点。
生物活性肽是近几年研究的成果，它具有主动吸收、吸收速度快、吸收完整、低耗和数量多等特点，另外活性肽还具有提高免疫力、稳定情绪、降低血压等功能，从生理功能上优于氨基酸和蛋白质，肽是取代氨基酸等营养物质的新兴营养品。
生物活性肽已经成为国际市场上新兴的生物高科领域的产品，是具有极大市场潜力的朝阳产业[6]。
然而目前以大豆、乳制品为原料制备低分子肽的研究很多，市面上的产品也较丰富，比如三九大豆调脂肽、三九减肥肽、三九降糖肽、激素肽、抗菌肽、抗癌肽等等，然而以核桃仁为原料制备的低分子肽制品却寥寥无几。
胡鑫等采用酶解技术制备了高质量低分子量核桃肽制品[7]，易建华等利用蛋白酶对核桃蛋白进行水解,结果Alcalase214L和Neutrase018L复合酶对核桃蛋白的连续水解产物肽链长度趋近于5[8]。
1.6核桃蛋白肽的化学组成
核桃蛋白肽是指核桃蛋白质经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程而获得的蛋白质水解产物，它由核桃蛋白水解后的多种肽混合物共同组成。
核桃蛋白中含有18种氨基酸，其中有8种必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量很高[9]。
蛋白质是人体所需的重要营养素之一，它在人体内以氨基酸或肽的形式被消化吸收[13-10]。
近年来研究发现非单一氨基酸形式的小肽类，在人类的生命活动中具有重要的生理功能[11]。
1.7核桃蛋白肽的应用
目前国内外关于核桃蛋白活性肽的制备研究还限于初级探索阶段，对核桃蛋白活性多肽的生理活性也没有深入地研究，市面上也未见具有相应生理功能的活性多肽产品。
因此对核桃蛋白活性多肽进行制备和生理功能的研究，并开发相应的产品，无论是对核桃蛋白的综深加工还是丰富人们的营养来源,都具有重要的现实意义。
1.8研究的目的及意义
目前，我国核桃油生产厂家已达数十家之多，榨油后的副产品—核桃渣的蛋白质含量高达53.89%，但通常将其作为饲料或直接废弃,使核桃的蛋白质资源未能得到充分利用并可能引发环境问题。
核桃蛋白由清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白组成，其18种氨基酸齐全，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理，接近联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）规定的标准，是一种很具开发潜力的植物蛋白。
为充分利用我国的核桃资源并提高核桃产品的附加值和市场竞争力，利用酶法对核桃蛋白质进行改性，不仅可改变其物化性质和功能特性，还有助于人体消化吸收，对核桃蛋白的开发利用具有十分积极的意义。
核桃蛋白含有18种氨基酸，其中8种必需氨基酸，氨基酸组成中，精氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸等含量相对较高。
近年来科学研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收，一些肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时具有多种生理功能，大量研究证实了活性肽具有抗氧化等作用；且研究表明，多肽的抗氧化性与其结构中含有上述氨基酸残基有关。
核桃是我国的传统出口产品，是国际市场的主要竞争者之一。
我国的核桃仁罐头也曾有2000余t的出口量，到20世纪初仅剩下600～700t。
另外，我国还从国际市场进口核桃及其加工产品。
2000年进口核桃800余t，核桃仁1000余t，以满足国内的外国人和高收入群体对黑核桃等稀缺品种及高档产品的需求，且进口量呈现出增长的趋势。
在国际市场上，美国是主要竞争者。
其出口市场与我国核桃及其制品的出口国基本一致，形成竞争。
目前，我国核桃深加工产品主要有核桃油、核桃蛋白、核桃粉、核桃乳及一系列的风味核桃制品。
对于采用传统方式加工的核桃油、核桃乳、核桃粉、风味核桃仁等核桃制品，向着综合开发，降低成本，扩大企业规模，创造名牌的方向发展，在保证加工产品质量的同时，应树立自己的民族品牌，使我国的核桃资源优势转变为经济优势。
在新产品的开发上，要借鉴外国的先进经验，可将我国的核桃口味与国际接轨，如核桃冰淇淋、核桃沙拉酱等制品。
1.9研究的主要内容及预期目标
1.9.1研究内容
（1）确定核桃蛋白提取的最佳工艺条件；
（2）桃蛋白的酶解工艺；
（3）核桃蛋白肽葡萄酒的研制；
（4）确定核桃蛋白肽运动饮料的
1.9.2预期目标
确定核桃蛋白提取的最佳工艺条件；确定发酵酒的最佳发酵条件；确定核桃蛋白肽运动饮料的配方；
2核桃蛋白肽的制备
2.1引言
核桃中油脂占到65%-70%外，核桃蛋白质含量占到14%-17%，是一种良好的蛋白源。
其提取的方法很多，相对而言，碱溶酸沉法操作简单，效果也较好。
核桃蛋白肽是由核桃蛋白质经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程而获得的蛋白质水解产物，它由核桃蛋白水解后的多种肽混合物共同组成。
核桃蛋白中含有18种氨基酸，其中有8种必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量很高。
2.2材料与设备
2.2.1材料与试剂
核桃仁盐酸氢氧化钠中性蛋白酶石油醚
2.2.2设备
烧杯玻璃棒离心机纱布漏斗铁架台数显电子恒温水浴锅标准型酸度计瑞士BUCHIB-290小型喷雾干燥仪
2.3方法
2.3.1工艺流程
2.3.2核桃仁脱皮
因为核桃仁外有一层种皮，它含有色素和苦涩味等成分，会严重影响产品质量,所以必须将它去除，在给核桃仁去皮时可分为两种方法：
第1种，可采用碱液浸泡去皮法进行脱皮；第2种，加热煮沸法，可直接放入蒸馏水中加热至沸腾，闷制一定时间后取出，手工进行去皮，当然还可以用微波，超声波辅助提取。
通过比较，碱液法去皮会使核仁的颜色有所变化，核仁品质降低，制备出的蛋白质呈微红色；加热煮沸法效果较好，可较好地的保障了核桃蛋白的品质。
2.3.3除油
将研磨好的核桃仁置于大烧杯中用石油醚浸泡12小时后倒出上层有油的石油醚，重新加入新的石油醚，放置12小时后又倒出有油的石油醚，再加入新的石油醚放置24小时后倒出石油醚，在105℃的烘箱中烘干核桃仁粉末，封口储存备用。
将含油的石油醚置于蒸馏装置中回收石油醚。
2.3.4核桃蛋白提取条件的优化
称取等量5g的核桃粉样品5份，采用固液比1：
30，pH调整到9.0，一组用磁力搅拌器搅拌1h（室温），不做其他任何处理，另外两组分别用超声波，水浴（55℃）条件处理1h，剩余两组在水浴1h后，进行微波、光波处理十五分钟。
冷却过滤，取上清液，酸沉，将酸沉出的蛋白质真空干燥，而后称重比较。
确定辅助条件。
选择提取温度、提取pH、提取时间、固液比四个因素进行正交试验，并分析制备过程中各个因素对于核桃粗蛋白的提取率的影响。
分别取同等的核桃粉5g，分别按正交表中各种条件方法进行提取核桃蛋白，本实验采用的正交试验如表5。
表5核桃蛋白制备中各个因素及其水平表
因素
水平
A
温度（℃）
B
pH
C
时间（min）
D
固液比
1
50
7.0
50
1：
90
2
55
7.5
60
1：
100
3
60
8.0
70
1：
110
2.3.5喷雾干燥
是利用雾化器将料液分散成雾滴，与热空气等干燥介质直接接触，使水分迅速蒸发的干燥方法。
本试验采用瑞士BUCHIB-290小型喷雾干燥仪。
适用于热敏性样品的干燥，因只是瞬间受热，能保持这些活性材料在干燥后仍维持其活性成份不受破坏。
2.3.6核桃蛋白质的酶解
采用中性蛋白酶酶解核桃蛋白质，查询资料[7]确定酶解的温度、pH值、底物浓度、酶和底物浓度之比、酶解时间。
2.4结果
2.4.1各种辅助方法的比较
表6各种辅助方法结果比较表
辅助提取法
提取率
碱提（磁力搅拌器）
水浴
超声波
水浴/光波
水浴/微波
13.84%
29.45%
48.83%
39.40%
42.55%
有此表可以看出，三种辅助提取方法相比较而言，超声波的提取率要远远高于碱提（磁力搅拌）、水浴、水浴/光波、水浴/微波组合，因此单因素及正交试验均以超声波为辅助提取方法进行提取。
2.4.2核桃蛋白提取正交试验
表7核桃蛋白提取正交试验安排及试验结果表
试验号
A
温度（℃）
B
pH
C
时间（min）
D
固液比
实验结果（%）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1（K1/3）
k2（K1/3）
k3（K1/3）
R
1
1
1
2
2
2
3
3
3
156.59
157.58
154.27
52.310
52.527
51.423
1.104
1
2
3
1
2
3
1
2
3
153.96
160.19
154.63
51.320
53.397
51.543
2.077
1
2
3
2
3
1
3
1
2
155.27
156.63
156.88
51.757
52.210
52.293
0.536
1
2
3
3
1
2
2
3
1
161.62
152.23
154.93
53.873
50.743
51.643
3.130
53
52.40
51.53
51.44
55.83
50.31
49.52
51.96
52.79
主次顺序
D﹥B﹥A﹥C
优化水平
A2B2C3D1
由表6可以看出提取核桃蛋白的最佳组合为A2B2C3D1，即温度为55℃，pH值为7.5，时间为70min,固液比为1：
90为最佳组合，对于因素主次顺序为D﹥B﹥A﹥C，即固液比﹥pH﹥温度﹥时间，因此温度、pH、固液比为主要影响因素。
2.4.3核桃蛋白酶解条件
酶解核桃蛋白的用酶是中性蛋白酶，其酶解条件是：
温度55℃、底物浓度5%、酶和底物浓度之比为500U/g、酶解时间为1小时，酶解pH为7.5。
酶解率可以达到36.7%。
2.5小结
核桃蛋白质提取最佳条件为碱溶pH值为7.5，蛋白质浓度为5％，酸沉pH值为4.0，此时核桃蛋白质提取率可达55.83％左右。
中性蛋白酶酶解核桃蛋白的条件是：
温度55℃、底物浓度5%、酶和底物浓度之比为500U/g、酶解时间为1小时，酶解pH为7.5，酶解率可以达到36.7%。
3核桃蛋白肽葡萄发酵酒的研制
3.1引言
核桃蛋白是一种很好的植物蛋白来源。
随着人们对核桃蛋白质的认识加深，具有高附加值的核桃多肽酒作为核桃蛋白的加工方向之一，必然会受到人们越来越多青睐，其生产及应用前景也非常广泛。
3.2材料与设备
3.2.1材料与试剂
酶解液葡萄柠檬酸白砂糖氢氧化钠
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