酵母菌的培养及观察.docx

酵母菌的培养及观察.docx

《酵母菌的培养及观察.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母菌的培养及观察.docx（31页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酵母菌的培养及观察

酵母菌的培养和观察

目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。

实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。

约在6000年前，就发明发面的方法。

直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。

对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。

材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。

步骤

1．观察酵母菌

（1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。

再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。

有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。

芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。

这种繁殖方法叫出芽繁殖。

（2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。

不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。

2．培养酵母菌

（1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。

等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。

然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。

这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。

（2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。

注意事项

1．观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其它杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其它杂菌区分开来。

2．发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。

分析和讨论

酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。

在一般情况下进行有氧呼吸。

如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。

其过程如下：

1．C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦（有氧呼吸）

2．C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦（缺氧呼吸）

建议培养酵母菌还可以采用下列两种方法。

1．用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养

（1）取10克豆芽放入100毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。

在滤液里加5克蔗糖和5毫升乳酸，配成液体培养液。

（2）把鲜酵母半块或老面（发酵后晾干的面粉团）打碎，投入培养液中，放在黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵母菌。

2．用巴斯德培养液培养

酵母菌需要的无机营养来自外界环境。

如果在培养液内适当增加氮、磷等元素，效果会更好。

巴斯德培养液的配方如下：

蔗糖15克，碳酸铵1克，磷酸氢钾0．2克，磷酸钙0．02克，硫酸镁0．02克，蒸馏水100毫升，培养方法跟上述的相同。

于运联中学生物学实验大全1994年12月

酵母菌的培养与转形作用

Ⅰ.目的

　　酵母菌（Saccharomycescerevisiae）是一种很有用的真核生物，他拥有生物的特性，可用原核生物的方式培养，其基因组较小，复制时间短，可作为基因分析，在分子生物学研究上的突破，很多都是以它为材料。

在工业上酵母菌也很重要，例如：

啤酒、面包、酒、重组胜和蛋白质之合成皆与酵母菌有关。

　　在重组DNA技术中，酵母菌（yeast）乃是一种很重要的寄主生物，可用质体DNA为媒介物引入外来DNA并表现之。

转型技术与大肠杆菌相似，但其方法需修饰以瓦解其细胞壁，常用的两种方式进行酵母菌的转型作用，一是使酵母菌形成Spheroplast，此法较麻烦需将细胞壁去掉，另一种是用碱性阴离子（例如：

LiCl或RbCl）加上热休克快速地处理完整的细胞，本实验用后者来实行，收集对数生长期的酵母菌细胞，经碱性阴离子及热休克处理，可使细胞外鞘发生变化，有利于吸收质体DNA，正如大肠杆菌一样（参照实验5），不同的因子会影响效率，质体DNA吸收能力与质体的大小、DNA的构形、寄主品系、筛选步骤有关，与大肠杆菌的转形作用相比有显着的差别是转形效率，酵母菌的转型效率在每1mg质体DNA中，约可获取103-104转形细胞。

II.酵母菌的培养

1.仪器用具：

a.30℃恒温箱

b.酒精灯

c.接种环

2.药品与试剂：

a.yeast菌株：

EGY48〔MAT,ura3,his3,trp1,LexAop（x6）-LEU2〕

YM4271〔MATaura3-52,his3-200,lys2-801,ade2-101,ade5,trp1-901,Leu2-3,112,try1-501,gal80gal4ade5:

:

hisG〕

Y187〔MAT,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,Leu2-3,112,gal4,gal80,cyhr2,LYS2:

:

GALUAS-HIS3TATA-HIS3,URA3:

:

GAL1UAS-GAL1TATA-LacZ〕

Y190[MATa,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-90,leu2-3,112,gal4,gal80,cyhr2,LYS2:

:

GAL1uas-HIS3TATA-HIS3,URA3:

:

GAL1uas-GAL1TATA-lacZ]

b.YPD培养液、培养基（参照实验4）

3.方法与步骤：

１）单一菌落（singlecolony）之分离，请参照实验4。

分别将酵母菌养于YPD培养液或培养基中，至于30℃之培养箱中约3-5天。

２）隔周实验前，取出酵母菌落并观察。

III.酵母菌转形作用

1.仪器用具：

a.30℃培养箱

b.离心机

c.干浴器

d.冰浴

2.药品与试剂：

a.minimalsynthuticdropout（SD）baseagar（clontech）

b.–Ura

c.1xTE/LiAc（0.1MLiAcinTE溶液）

d.40﹪PEG4000

e.DMSO

3.方法与步骤：

１）制备胜任酵母菌的前一天，接种酵母菌EGY48于3mlYPD培养液中，置于30℃恒温箱中振荡培养（230-250rpm）过夜。

２）准备10mlYPD培养液，加入300l过夜菌液，使OD600=0.4~0.6。

３）在室温下以2200rpm离心5分钟，倒去上清液，加入5ml水悬浮酵母菌。

４）在室温下以2200rpm离心5分钟，倒去上清液，加入新鲜的100l1xTE-LiAc悬浮。

５）加入0.1~0.5gp8OP-LacZ质体DNA及0.1mg片段精子DNA携带者。

６）加入600lPEG-LiAc（0.1MLiAc,40﹪PEGinTE）混匀，置于30℃恒温箱中振荡培养（200rpm）30分钟。

７）加入70lDMSO，混匀并热休克42℃15分钟，迅速至于冰浴中2分钟。

８）在室温下以14,000rpm离心5秒，倒去上清液，以100lTE悬浮并涂

于SD/-Ura培养基中，置于30℃恒温箱中3~5天。

http:

//www.ndhu.edu.tw/~life-science/exp/choice.htm

实验4质体DNA之基本操作技术

I.目的

　　本实验介绍培养液（broth）或培养基（plate）的制备、大肠杆菌的培养、菌种保存与生长曲线所使用的基本技术。

II.培养液（基）的制备

1.培养细菌或酵母菌（yeast）其培养基必须提供下列几种基本的营养条件：

（1）碳源作为能源

（2）水分（3）氮源（4）磷（5）硫（6）不同的矿物质养分，如铁和镁。

大肠杆菌和酵母菌能在只有一种碳源（如葡萄糖）与简单的氮源（如氯化铵、硫化铵及磷、硫等矿物质）的简单培养基中生长，酵母菌则还需要几种维生素。

实验研究上常用到一些复杂的培养基，其主要成分则由复杂的养分（包括植物或动物）所提供的一些不详萃取物。

例如LB和YPD培养液，其主要成分是酵母菌萃取物（yeastextract）和蛋白月柬（peptone,一种水解的蛋白质）所组成，这些材料和胺基酸以及不明的辅助因子混合在一起，如维生素等形式提供不同的碳源和氮化合物。

液体培养基就是将各成分溶于水中即可，若加入洋菜（agar，从红藻中萃取出来的复杂萃取物，与洋菜胶agarose不同，请勿用错）则成固体培养基。

洋菜是固体微生物培养基理想的凝固剂，因它具有良好的溶解特性，但对大部分细菌及酵母菌而言则不具营养价值。

固体洋菜在90~100C会溶解，液体洋菜在约42C时凝固。

灭菌步骤可去除所有活的微生物，培养基在做纯系培养时必须将所有的微生物去除，培养容器则要密封或用棉花、锡箔盖住以避免灭菌后又遭污染。

纯系培养过程中所用的液体及容器可用不同的方法消毒，包括高温、放射线照射、过滤等将微生物杀死。

制备培养基常需要高压灭菌锅（autoclave），让培养基在特定时间内暴露于高温高压中，通常是121C的高温，蒸汽压15Psi，灭菌20分钟。

2.仪器用具：

a.高压灭菌锅（autoclave）

b.磁性搅拌器

c.天秤

d.pHmeter

e.水浴槽

f.无菌操作台

3.药品及试剂：

a.Tryptone（代替peptone）

b.yeastextract

c.NaCl

d.Agar

e.ampicillin

4.方法步骤：

全班区分数组各制备不同的培养液或培养基。

（A）LB培养液：

1）在500ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract+1gNaCl，加水至100ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。

若用玻瓶装，则旋松盖口（待灭菌后降温再旋紧）。

2）高温灭菌锅消毒。

注：

高压灭菌后必须等它慢慢排气，只有当气体完全排除后，才能安全地打开灭菌锅，戴耐热手套取出材料，消毒20分钟实际需要约40分钟，因为还要把空间加热及排气时间包括在内。

（B）LB固体培养基：

１）在500ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract+1gNaCl+1.5gagar，加水至100ml刻度并用磁性搅拌器混合，agar此时无法溶解成悬浮状，瓶口以铝箔纸盖住。

２）高温灭菌锅消毒。

３）灭菌后，小心将瓶放在50C水浴中，使其降温30分钟。

４）在培养基凝固前，倒入微生物用的培养皿（petridish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明"LBplate"及日期，放在室温或4C中备用。

（C）Ampicillinplate：

1）如同前项（B）步骤1）至3）。

2）在培养基凝固前，迅速加入ampicillin使成最终浓度为100g/ml，摇晃均匀，倒入微生物用的培养皿（petridish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明"Ampplate"及日期，放在室温或4C中备用。

（D）YPD培养液：

1）在250ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract，加水至50ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。

2）高压灭菌消毒。

3）冷却至55C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为2%。

（E）YPD培养基：

１）在250ml锥形瓶中加入1gtryptone+0.5gyeastextract+1gagar，加水至50ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。

２）高压灭菌消毒。

３）冷却至55C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为2%。

4）倒入微生物用的培养皿（petridish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明"YPDplate"及日期，放在室温或4C中备用。

III.大肠杆菌的培养

（A）单一菌落（singlecolony）之分离：

1.利用微生物的生物技术作纯系（pureline）的保存，常依据纯系培养，常见的有稀释技术或画线法，本实验将介绍后者，乃在培养基表面把混合培养的菌涂开或画成线，让个别的细胞分开。

每个分离的细胞会长成一个菌落（colony），可获得一个纯系培养。

2.仪器用具：

a.37C恒温箱

b.酒精灯

c.接种环

3.药品及试剂：

a.E.coli菌株:

DH5

b.LB及LBplate

4.方法步骤：

１）上课前一天，自-70C取出储存的菌种，培养在LB培养液中并置于37C恒温箱中振荡培养过夜。

２）每组取1个LBplate，在培养皿底部标明组别、日期及"DH5"。

３）将接种环在酒精灯焰上烧红，环上方部分亦以火焰烧过，将接种环在空白LBplate处轻戳数次以使冷却。

４）取过夜菌液，将接种环浸一下。

（若为培养基，则轻刮一个菌落）。

５）打开空白LBplate，将沾有菌落的接种环在其上轻轻连画数条横线，画法各异请参阅图，唯再次画前需将接种环重复火焰灭菌的步骤。

（B）菌落的移殖接种（inoculation）技术

1.生物技术学者均需利用无菌技术，小心操作，才能避免在移殖接种中被不想要的微生物污染。

2.仪器用具：

同上

3.药品及试剂：

同上

4.方法步骤：

基本上同前，唯一差别是接种于LBbroth中。

IV.菌种保存

1.菌种保存于15%glycerol（甘油）中，可保存在低温（-70C）中数月甚至数年。

2.仪器用具：

a.37C恒温箱

b.–70C冰柜

3.药品及试剂：

a.50%glycerol（autoclaved）

b.2mlvial螺旋式保存管

4.方法步骤：

１）于无菌操作台中，将长至mid-logphase之菌液取出700l置于2ml螺旋式保存管中。

２）加入300l50%glycerol混合均匀。

３）标示菌种名称及日期，置于-70C冰柜中保存。

V.生长曲线

1.分子生物学中无论是进行胜任细胞的制备，或获得可重复生产之质体DNA及生产重组蛋白质，都必须先了解生物之生长特性。

若要获得生长均一的菌类，就必须取对数生长期或指数期的菌类，此时族群中每个细胞之生长速度和成分接近相同。

不同培养基依其营养条件及通风情形（氧气）的良好与否，其生长曲线多少会有变化。

基本上生长过程包括了呆滞期（lagphase）、对数期（exponentialorlogphase）、停滞期（stationaryphase）和死亡期（deathphase）。

2.仪器用具：

a.37C恒温箱

b.spectrophotometer

c.酒精灯

d.接种环

3.材料：

E.coli菌株:

DH5

4.方法与步骤：

１）测量生长曲线前一天，自-70C取出储存的菌种，培养在LB培养液中并置于37C恒温箱中振荡培养过夜。

２）各组准备10mlLB培养液，加入50l过夜菌液，置于37C振荡培养。

３）接种1小时后，每隔30分钟取少量菌液测其OD600值，background为LB培养液。

４）以横轴为时间，纵轴为细菌数目取对数（log）做图，画出DH5的生长曲线。

注：

1个OD600值约含8108个细菌

啤酒酵母菌01

啤酒酵母菌02

酵母菌污染后生长液似乳白色浑浊，就像北方做馒头用的酵母粉溶于温水中的那种颜色，差不多吧

用灭菌水溶解硫酸铜,温箱里面如37度,就加硫酸铜到饱和,100毫升要25克（30度的溶解度）.

1.彻底通风，停止使用1周；

2.甲醛（福尔马林）熏蒸24小时：

密闭实验室，将甲醛倒入固体高锰酸甲中，（小心，会喷出来，容器大些，下垫报纸宽些，倒完立刻跑掉，注意安全）。

之后通风24小时，味散后进入实验室开始实验。

预防为主.我们的是加如硫酸铜在煮过的蒸馏水里.即培养箱里的水盘本身加有防止霉菌的东西.

不知你们后来的处理如何?

能否写出来供我们参考使用.

8个小时，时间短点，用普通肉眼观察差点意思。

影响因素有接种量、培养条件、菌中保存与复苏等。

用（D）右旋葡萄糖没问题。

也许得多培养几个小时，我遇到过这种问题，是细胞冻存不好造成的。

葡萄糖是（D）右旋的

酵母双杂交实验疑难解析

问：

如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？

答：

在有些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。

重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5个100-mm的SD/–Trp平板。

在30℃下温浴，直至平板上的克隆互相粘在一起。

用5ml0.5XYPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中。

接着就使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

问：

我的诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？

答：

该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。

这可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活。

但重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

问：

转化效率太低，怎么办？

答：

1.检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。

2.DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。

3.不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。

4.检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1x105colonies/mgDNA以上。

问：

杂交效率不高，该如何处理？

答：

在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。

当你对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的，新鲜的克隆进行培养。

经过离心和重悬后，使用血球计对细胞进行计数。

密度应该在1x109/ml。

一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。

你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。

或者使用表达水平较低的载体。

也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。

但同时必须作杂交对照实验。

细胞的酵母污染图片

Didyouusethecloneyoftheyeastcellortheovernightcultureyeastcellstoculture?

Usingtheovernightculturecellscangrowfaster.

Goodluck!

1检查一下YPDA的pH，

2确定你的细胞的活力是好的

3培养或盛YPDA的容器中有没有抑制酵母生长的物质或是未洗干净

基本说明

通过将组织细胞裂解后，以RNaseA和ProteinaseK消化降解RNA和蛋白质。

然后经过简单抽提、沉淀获得基因组DNA。

本试剂盒适用于从人或动物的血液、培养细胞、各种组织、Gram+/Gram-细菌中快速抽提基因组DNA。

主要特点

1．整个抽提过程30分钟，氯仿抽提仅一次，无需酚抽提。

2．本试剂盒抽提DNA能用于几乎所有分子生物学实验。

3．按样品准备方法得到的200µl样品中可获得2~10µgDNA。

从上面的介绍看适合于提取酵母基因组DNA

酵母DNA在高盐浓度条件下，DNA吸附于玻璃珠上，吸附了DNA的玻璃珠经离心、洗涤去掉盐和杂物后，进行洗脱重悬于水或TE缓冲液中。

DNA回收率高而无降解，操作简单、快速、方便。

玻璃珠SIGMA有，可以问问代理。

也可以使用蜗牛酶裂解法破酵母细胞壁法。

告诉你一种简便实用的提取酵母质粒的方法，其纯度完全可以用来测序和做PCR。

你可以尝试一下。

氯化苄提取真菌基因组的方法。

在1.5mlAppendorf管中加入0.1g菌体和500ul提取液，振荡使之充分混合，再加入10％SDS100ul，氯化苄300ul，剧烈振荡，使管内混合物成乳状。

50度保温1h，每隔10min振荡混合一次，然后加入300ul3mol/LNaCl（ph＝5.2），混匀，冰水浴15min，6000rpm，15min，收集上清，加入等体积无水乙醇，室温沉淀20min，这时会有絮状沉淀出现。

10000rpm，15min，沉淀用70％乙醇洗一次，室温尽量挥发残留的痕量乙醇，但不要让DNA完全干燥，加入50ulTEbuffer溶解DNA。

提取液：

0.1mol/LTris-HCL,PH=9.0+0.04mol/LEDTA,PH=8.0

整个过程也就氯化苄可能需要购买，不过它的价格也非常便宜，500ml只需要32元。

^_^

酵母RNA试剂盒的如华舜的，效果还是不错；

下面是我收集的有关酵母基因提取的方法，你也可以参照《分子克隆》上的方法：

1.Transfer1.5mlofliquidcultureofyeastgrownfor20–24hat30°CinYPD（1%yeastextract,2%peptone,2%dextrose）intoamicrocentrifugetube.Pelletcellsbycentrifugationat20,000×gfor5minutes.

2.Add200μloflysisbuffer（2%TritonX-100,1%SDS,100mMNaCl,10mMTris-HCl,pH8.0,1mMEDTA,pH8.0）.

3.Immersetubesinadryice-ethanolbathfor2minutes,transfertoina95°Cwaterbathfor1minute.Repeat;vortex30seconds.

4.Add200μlofchloroform;vortex2minutes.

5.Centrifuge3minutes,roomtemperature,20,000×g.

6.Transfertheupperaqueousphasetoamicrocentrifugetubecontaining400μlice-cold100%ethanol.Mixbyinversionorgentlevortexing.

7.Incubateatroomtemperature,5minutes.Alternatively,precipitateat-20°Ctoincreaseyield.

8.Centrifuge5minutes,roomtemperature,20,000×g.RemovesupernatantwithapulledPasteurpipettebyvacuumaspiration.

9.Washthepelletwith0.5ml70%ethanol,spindownasdescribedinstep8above.Removesupernatant.

10.Air-dr