核酸提取纯化常见问题解答.docx

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核酸提取纯化常见问题解答

核酸提取纯化常见问题解答

1.AccuPrep®凝胶回收试剂盒常见问题

2.AccuPrep®基因组DNA提取试剂盒常见问题

3.AccuPrep®GMO提取试剂盒常见问题

4.AccuPrep®PCR纯化试剂盒常见问题

5.AccuPrep®质粒提取试剂盒常见问题

6.AccuPrep®粪便DNA提取试剂盒常见问题

7.AccuPrep®病毒RNA提取试剂盒常见问题

8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题

9.质粒DNA提取操作常见问题

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Q1.产量低

A1.1）凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。

离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全，DNA被包裹不

            能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致DNA产量降低。

      2）加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗?

过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。

      3）错误的洗脱缓冲液会降低产量.洗脱缓冲也不能包含过多的盐.缓冲液的pH应调至7.0-8.5。

      4）错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH

            在正常范围内。

如果颜色为红色或橘黄色，表示pH已经超出了正常的范围。

这时应该加入几滴醋

            酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。

      5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。

如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸

            附力，从而导致DNA产量的降低。

Q2．琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中

A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。

WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。

如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次。

Q3．提纯后的后续酶反应效率降低

A3.1）样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。

这种情况下，加入W缓冲液到结合柱后放置结合柱5分钟，然后再离心。

2）样品中含有残留的WB缓冲液，残留的乙醇会抑制后续的酶反应，结合柱必须要完全晾干。

如果问题仍然存在,第二次离心后让结合柱晾干10分钟。

3）一起被洗脱的玻璃纤维影响了酶的活性，再离心1分钟，转移上清液到一个新的离心管中。

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Q1.DNA产量或纯度低

A1.1）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。

           确保试剂到货后存放于室温（15-25℃），试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污

        染。

冻干试剂溶解后应分装并于–20℃保存。

      2）在洗涤缓冲液1和2中没有加入无水乙醇。

            加入乙醇后，充分混匀洗涤缓冲液W1和W2，并且作标记，表明乙醇己加入。

      3）试剂和样本没有充分混匀。

            每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。

      4）您可能没有选用适合的试剂来洗脱DNA。

            洗脱DNA需要碱性条件，使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱。

      5）裂解可能不完全。

            确保裂解液从混浊变的澄清，表明蛋白质已经降解。

根据组织类型不同需要的裂解时间会有差

         异。

裂解通常需要1-3小时，为保证其效率，可以使用振荡水浴的方法（如实验操作中所述）。

         样品中加入蛋白酶Ｋ后要立即混匀。

裂解液加入结合柱前将样品与异丙醇充分混匀。

      6）从组织中提取的产量低。

            在进行消化与裂解步骤之前确保组织破碎为小块（或粉末状），以下两步增加了与蛋白酶Ｋ一起

         孵育的时间：

A将组织与蛋白酶Ｋ孵育过夜。

B.将组织与蛋白酶Ｋ孵育3~4小时，然后加入新

         鲜的蛋白酶Ｋ30µl再孵育1~2小时。

    7）产物在260nm处的吸光值（A260）太高。

           结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。

这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值

        读数。

在最后的洗脱阶段，太多的离心也可能导致将结合柱中的玻璃纤维洗脱下来，除去玻璃纤

        维的方法如下面所述。

Q2.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全

A2.结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。

这些纤维会抑制酶切反应。

最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心１分钟，可以在管底看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。

Q3．组织样本中的DNA降解

A3.获得的组织样本应立即-20°C冷冻保存，直至开始裂解步骤。

使用研钵和研棒在液氮作用下将组织研磨成粉末，在没有裂解的组织中可能有核酸酶活性。

Q4．血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色

A4.结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200µl洗脱液与200µlGC缓冲液混合，再加入100µl异丙醇，重复纯化步骤。

Q5．在某些缓冲液中有白色沉淀（TL或GC缓冲液）

A5.经过在低温下的长期存放，组织裂解缓冲液或结合缓冲液中可能出现白色沉淀。

在60°C孵育可使沉淀溶解。

沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。

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Q1.DNA产量或纯度低

A1.1）试剂盒保存条件不适当。

到货后存于15-25℃。

      2）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。

          确保试剂到货后存放于室温（15~25°C），试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH值及稳定性，避免污

       染。

冻干试剂溶解后应分装并于2~8℃或-15~-25℃保存。

      3）使用前在洗涤缓冲液中没有加入无水乙醇。

加入乙醇后充分混匀并存于15~25℃。

做标记标明是

  否已加入。

      4）试剂和样本没有充分混匀。

每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。

Q2.DNA洗脱回收率低

A2.可能使用了不适当的洗脱缓冲液。

不要用水洗脱，请用试剂盒中提供的洗脱缓冲液洗脱。

Q3.提取的DNA不能够被酶切或酶切完全

A3.结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。

这些纤维会抑制酶切反应。

最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心１分钟，可以在管低看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。

Q4.产物在260nm处的吸光值（A260）太高

A4.结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。

这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。

除去玻璃纤维的方法如上所述。

Q5.DNA产量低

A5.1）蛋白酶K溶解不完全。

按照下面步骤完全溶解蛋白酶K:

          1.吸取2.5ml双蒸水加入蛋白酶K冻干粉小瓶中。

          2.盖上瓶盖，颠倒几次使蛋白酶K完全溶解。

          3.分装并做标记，存于–15to-25°C。

          注意:

按照此种方法溶解的蛋白酶K至少可稳定存放12个月。

      2）裂解不完全。

加入蛋白酶K后立即将样本混匀。

裂解液加入结合柱前要与异丙醇彻底混匀。

Q6.从组织中提取产量低

A6.蛋白酶K消化不完全。

确保消化与裂解步骤之前组织破碎成小块。

有两种方法增加孵育时间：

.组织与蛋白酶K一起孵育过夜,或孵育蛋白酶K3~4小时，再加入30μL蛋白酶K温育1~2小时。

Q7.组织样本中的DNA降解

A7.在没有裂解的组织中存在核酸酶活性。

组织在进行裂解步骤前应该冻存于-20°C，样品进行匀质化时使用小块组织（20-40mg）。

Q8.血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色

A8.结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200µl洗脱液与400µl结合缓冲液混合，再加入100µl异丙醇，重复纯化步骤。

Q9.在PL缓冲液和B缓冲液中有白色沉淀

A9.经过在低温下的长期存放，PL缓冲液或B缓冲液中可能出现白色沉淀。

在70°C孵育可使沉淀溶解。

沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。

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Q1.低产量

A1.1.您是否将PCR产物与结合缓冲液充分混匀？

不足浓度的离液盐不会增加DNA与结合柱的吸附。

      2.您是否在洗涤缓冲液中加入了足量的无水乙醇？

浓缩的洗涤缓冲液可以洗去结合的DNA。

      3.使用不正确的洗脱缓冲液可能会降低产量。

洗脱缓冲液不能含有太多盐离子，最适pH值应为7.0-

           8.5。

Q2.样品在琼脂糖凝胶中上样后漂浮

A2.样品可能包含残留的洗涤缓冲液因而导致漂浮。

必须离心确保柱子中没有挂壁的液滴。

如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10min，然后再进行洗脱。

Q3.后续酶切反应不正常

A3.1.样品中高浓度的盐离子会抑制酶切反应，这种情况下，应在结合柱中加入洗涤缓冲液后静置5min,

          再离心。

      2.样品中包含残留的洗涤缓冲液，残留的乙醇影响酶切反应的进行，结合柱必须完全干燥。

如果这种

          情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10min，然后再进行洗脱。

      3.玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，离心1min将上清转移至一个新管即可。

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Q1.质粒产量低

A1.1.您是否收集了足够数量的细胞?

产量依赖于宿主菌型，细胞过量也可能会使产量降低.请参阅附录。

      2.您是否使用了重悬缓冲液充分悬浮细胞？

不完全重悬浮细胞会降低裂解效率。

      3.中和缓冲液中是否有盐沉淀？

涡旋振荡重新使沉淀溶解。

离液盐浓度不适当会导致产量的降低。

如

          果沉淀不易溶解，可于60℃加热。

      4.加入RNaseA干粉后试剂是否保存超过了６个月？

低浓度的RNaseA可以导致质粒产量低，６个

          月后，再加入一些RNaseA，至多达到100µg/µl。

Q2.染色体DNA污染（电泳分析时出现了杂带）

A2.在第三步，样品不能够涡旋和剧烈振荡，裂解时间不能超过５分钟，这些都可能切断染色体DNA，轻柔处理裂解液。

Q3.进行琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮

A3.样品含有残留乙醇导致了漂浮，离心后必须使柱子完全干燥，确保结合柱内无挂壁液滴。

Q4.序列分析时有许多背景条带

A4.您是否检查了宿主E.coli菌株的内切酶活性？

HB101,JM系列及正常野生型宿主有很高内切酶活性，通过降解质粒干扰测序反应。

对于这些类型，需要第七步变性过程。

Q5.样品中含有RNA

A5.1.收集细胞的量过多。

我们推荐使用适当的量，根据附录中显示的宿主细胞光密度。

      2.RNase活性减弱。

RNaseA干粉加入到重悬缓冲液中保存超过6个月以上，RNase活性会减弱，

          需再加入一些RNaseA干粉，多至100µg/µl。

Q6.玻璃纤维的洗脱

A6.玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，以最大速度离心1min，上清转移至一个新管即可。

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Q1.提取后DNA纯度过低

A1.1.试剂盒的储存条件不正确。

®试剂盒到货后需要15-25℃保存.

      2.缓冲液和其他试剂暴露在影响其活性的环境下。

 ®所有缓冲液均应保存于15-25°C。

试剂瓶使

          用后均要盖好盖子以保护其pH值和稳定性，避免污染。

任何冻干的试剂被稀释使用后都要储存在

          2-8℃或-15--25℃。

      3.洗涤缓冲液（WBuffer）中没加乙醇。

®WBuffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。

加入后混

          合好，并储存于15-25℃.做好标记以便区分是否已加入乙醇。

      4.样品和试剂没有完全混合。

®每一步加完试剂到样品中后，都要充分混匀。

Q2.洗脱后，DNA的回收率低

A2.可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱DNA.洗脱液需要用碱性的缓冲液。

à下次实验时不要用水洗脱DNA，用试剂盒中的洗脱缓冲液洗脱DNA。

Q3.提取的DNA用限制性酶切不完全或完全不能进行酶切

A3.玻璃纤维可能会同DNA一起被从柱子中洗脱，它会影响内切酶的活性，最后的洗脱步骤完成后，离心机调到最大速度离心一分钟.玻璃纤维可能在管底被观测到。

将上清液转移到一个新的管中，注意不要带走管底的玻璃纤维。

Q4.用分光光度计定量时A260值过高

A4.玻璃纤维可能同DNA一起从柱子中洗脱下来，它也有吸光作用导致A260值过高 ®除去玻璃纤维的方法同上述方法一样。

Q5.DNA产量过低

A5.a.蛋白酶K没有被完全溶解。

按如下的操作步骤完全溶解蛋白酶K:

         1）.取1.25ml的双蒸水到盛有蛋白酶K的管中。

         2）.盖上管盖，颠倒几次直到蛋白酶K完全溶解。

         3）.分装后储存于–15to -25℃.*注意:

用这种方法储存得当，蛋白酶K的活性可以保存1年以上。

      b可能裂解不完全。

®加入蛋白酶K后立即将样品混合好。

在样品加入结合柱之前，一直搅拌将异丙

          醇和裂解产物混合好。

Q6.SL缓冲液或ST缓冲液中出现白色沉淀

A6.在长时间的低温下保存SL缓冲液或ST缓冲液，其中会出现白色沉淀。

®任何在SL缓冲液或ST缓冲液中出现的白色沉淀，都必须在70°C下加热溶解.沉淀并不影响缓冲液的功能,高温溶解沉淀也不会增加提取核酸的产量。

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Q1.提取后的RNA纯度低

A1.1.试剂盒的保存温度不正确，试剂盒需要15-25℃保存。

      2.加入Poly（A）到VB缓冲液后混合完全。

      3.洗涤缓冲液（WBuffer）中没加乙醇，WBuffer使用之前要先加入适量的无水乙醇。

混合好后储存

          于15~25℃。

做好标记以便区分。

      4.样品和试剂没有混合完全，每一步试剂加到样品中后，都要充分混合。

Q2.洗脱后，RNA的回收率低

A2.可能没有用适合的洗脱缓冲液去洗脱RNA.洗脱液需要用碱性的PH缓冲液.à下次实验时不要用水洗脱，请使用用试剂盒中的洗脱缓冲液进行洗脱。

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Q1.产量低

A1.1）溶解不完全使产量降低。

不足浓度的离液盐影响DNA与硅基质表面的结合。

      2）您是否在W缓冲液中加入了足量的乙醇？

浓缩的W缓冲液可能会洗去结合的DNA。

      3）使用不适当的洗脱缓冲液可能降低产量。

洗脱缓冲液不应包含太多的盐。

缓冲液pH值应调至7.0-

        8.5。

      4）不适当的结合条件如高pH值会降低产量。

SB缓冲液包含pH指示剂，颜色为黄色。

超出pH范围后

     颜色变为红色或橙色。

这种情况下可加入醋酸钠调整pH值至适当范围。

      5）切割的胶块太大，多于400mg的凝胶即会导致DNA结合效率的降低。

Q2.后续酶切反应受到影响

A2.1）样品的高盐浓度抑制酶切。

这种情况下可使用W缓冲液洗脱两次。

      2）样品包含残留的W缓冲液。

残留的乙醇抑制酶切反应。

      3）不完全去除硅基质会降低后续酶切反应的活性。

因为基质有可能结合蛋白质。

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Q1.质粒产量低

A1.1）您是否收集了足量细胞？

产量依赖于宿主类型。

过量的细胞也会导致产量降低。

      2）您是否使用溶液I完全重悬了细胞？

不完全重悬会降低裂解的效率。

      3）在溶液II,III或SB缓冲液中是否有盐沉淀？

涡旋或震荡使沉淀溶解。

离液盐浓度不适当会降低产量,

        如果沉淀不易溶解，可加热到50℃。

Q2.染色体DNA污染（琼脂糖凝胶电泳时出现了非预期条带）

A2.在第4步，样品不应涡旋或剧烈震荡，裂解时间不应超过5分钟，否则均可能导致染色体DNA断裂污染样品。

处理裂解液时操作要轻缓。

Q3.琼脂糖凝胶电泳上样时样品漂浮

A3.样品可能包含残留的W缓冲液。

样品中残留乙醇会导致漂浮。

必须使样品完全干燥但不能过干。

Q4.序列分析时出现太多背景条带

A4.您是否检查了宿主E.coli的内切酶活性？

HB101，JM系列及正常野生型宿主都有很高的核酸内切酶活性，通过降解质粒DNA干扰了测序反应。

这时应该增加第11步的孵育时间。

Q5.样品包含RNA

A5.收集的细胞太多。

我们推荐使用的细菌培养物体积要适当。