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文稿
边栏附注
前言
John:
嗨，大家好！
我是JohnHenderson，安捷伦科技公司的一名应用科学家，和我在一起的是资深科学家RonMajors。
今天我们将继续为您介绍另一个LC故障排除的话题。
在这一部分，我们将同您讨论HPLC仪的压力问题，过高的压力会给您的色谱柱和色谱结果带来麻烦。
Ron?
Ron:
这是一个重要的话题，柱压改变是我们最常见到的问题之一。
不断变化的柱压往往是色谱系统或色谱柱出现异常的一种征兆。
当微米级的颗粒填入色谱柱，泵推动液体通过这些颗粒时，将会产生很大的阻力。
对液流的这个阻力是系统产生背压的原因。
John:
有不少因素会影响系统压力…
Ron:
是啊，有五个…
不断变化的压力往往是系统或色谱柱出现异常的一种征兆。
理解压力变化的原因—压力方程
Ron:
让我们看一看压力方程，快速了解都有哪些因素影响柱压。
[insertpressure_equation.gif]。
首先，是溶剂黏度[indicatetheviscosityfactoronpressure_equation.gifORputinabuildoftheslide,withjustthefirstlabel,forviscosity,showing]。
溶剂的黏度越大，推动液体通过填充柱床需要的力量就越大，因此，压力会上升。
例如，假如您以前一直在反相HPLC中使用乙腈作为有机溶剂，现在如果换为黏度很大的异丙醇，您系统的压力会马上随着黏度的增加而呈比例地上升。
假如您对常用于梯度洗脱的水-甲醇流动相很熟悉，您应该知道混合溶剂的实际黏度会随着其组成的变化而变化。
让我们来看一看这张曲线图[insertviscosity_pressure.gif]。
从图中我们可以看到，100%纯水时，其黏度（和压力）是相当低的。
但是随着甲醇量的增加，实际黏度上升，并在甲醇比例约为45%时达到最大。
加入更多甲醇将降低系统压力，在100%纯甲醇时，压力甚至比刚开始时还要低。
这种压力的变化是由于梯度洗脱过程中流动相黏度的变化引起的。
假如您的系统已经在一个很高的压力下工作，那么由于黏度变化造成的压力些许上升可能会带来问题，它可能会造成系统压力超限并导致停泵。
影响压力的第二个因素是流速。
泵推动流动相液体通过色谱柱的速度越快，由流速导致的反压就越高。
[Showpressure-equationagain,andcircle“L”]第三个影响因素是L，即柱长。
色谱柱越长，需要推动流动相液体通过柱子的压力就越大，因此举例来说柱长加倍，压力也加倍。
但是在压力方程中，可能最不容易令人理解的因素是粒径[showpressure_equationagain,circletheparticlediameter]，因为粒径的平方与压力呈反比。
因此，当粒径减小一半时，压力上升到原来的四倍，即2的平方。
对于新型的亚2微米填料色谱柱，压力会变得很高，因此，一种叫做超高压LC（UHPLC）的全新技术应运而生。
您还会从方程中注意到[showpressure_equation.gifagain,andcirclethe“r”]，柱内径与压力呈反比。
保持流速不变，如果您将色谱柱内径从4.6mm降到2.1mm，压力会上升5倍。
现在您理解了都是哪些因素会使柱压下降。
那么让我们看看我们可能遇到的导致压力变化的常见问题。
实际上，我们有三种类型的压力问题。
最常见到的是压力过高。
柱压极少出现剧烈变化，柱压的变化通常是逐渐发生的。
第二个是压力过低。
有一些情况，柱压是下降的而不是上升的。
第三种是压力波动，即压力持续不断的变化着。
下面我们来分别讨论这几种情况。
压力方程概括了五种影响系统压力的关键因素：
溶剂黏度、流速、柱长、柱内径和填料粒径。
影响压力的HPLC系统原因
John:
好，我们先来看一看影响压力的HPLC系统上的原因。
包括检测器出口连接的流动相废液管，系统整个流路中出现的任何障碍物都会限制流动相流动。
为了减小柱外峰展宽效应，我们在HPLC中时常采用极小内径（ID）的管线，因此管子本身也会带来背压。
事实上，现在要使一些非常高效色谱柱的性能得到实现，经常需要连接极窄内径的管线，如0.12mmID的管子。
从泵到检测器，即使没有连接色谱柱，由所有这些管子带来的系统背压也存在。
因此，仪器硬件对整个系统压力生成是有一定作用的。
Ron:
当然，任何时候有东西滞留在这些细管线内的任何部位，如一粒尘土、一片金属屑或其它类似的东西都有可能会改变您系统的压力。
所以像管线、接头、流通池、在线过滤器及其它小体积的系统部件，都很可能驻留障碍物，从而影响您系统的压力。
如果任何这些地方存在液流限制，压力通常都会上升。
如果这些微粒流经检测器，那对于流通池将是灾难性的，因为流通池不能承受很高的压力从而导致其漏液，甚至在高压下破碎。
John:
好，现在我们来讨论一下如何处理压力故障问题。
造成HPLC系统压力上升的原因包括从泵出口到检测器出口连接的流动相废液管的整个流路中的存在的障碍物。
使用窄内径（ID）管线来减小柱外体积非常重要。
并且应使用能满足需要的最短的管线进行部件连接。
寻找产生压力问题的原因
John:
寻找产生高压的来源时常是故障排除中很费时的一个环节。
Ron:
是的，正是这样。
所以您对流路了解越多，您就能越快发现产生压力问题的来源。
让我们设想我们经历了一次超压情况[showchemstationscreenwithoverpressureindication]，它使我们的色谱仪停止运行。
要解决这个问题，我们必须定位流路阻塞的来源。
John:
[setupinstrumentwithoutguard]这里我们采用一台Agilent1200RRLC进行演示。
判断压力升高或流路阻塞是来自系统还是色谱柱，开始诊断的最简单的办法就是从系统上拆掉色谱柱。
假如压力立即下降了[showchemstationscreen,withpressureflow]，我们基本可以确定色谱柱就是原因所在。
Ron:
假如有保护柱或在线过滤器[setupinstrumentwithguard;pointtoin-linefilterandguardcolumn]，我们也应该依次把它们拆除[JohndemonstratesasRonspeaks]，观察流路阻塞是否发生在这些部件的某个当中。
如果系统压力在拆除了色谱柱（或保护柱或在线过滤器）后仍很高，我们就必须从色谱柱开始“逆向”进行诊断工作[showschematicagain,witharrowpointingfromcolumntowardtheautosampler]，弄清楚流路阻塞的位置。
那么，下一个可能的流路阻塞就可能发生在连接进样器和色谱柱的毛细管管路上。
拆除这段管线，我们很快就能查明堵塞是否发生在这里。
假如压力依然很高，我们就需要继续“逆向”诊断，一次只拆除一个部件，直至找到流路阻塞的位置。
一旦定位了原因所在，故障部件必须更换，如此即可解决背压超高的问题。
寻找故障来源最简单的方法是从仪器上拆除色谱柱，然后观察这是否“修复”了故障。
您可以逆向进行诊断工作，依次拆除过滤器和保护柱等，找到压力故障点。
您也应该把毛细管线连接处作为堵塞可能发生的位置来考察。
阻塞的筛板
我们也应该考虑您的HPLC色谱柱内部会发生什么情况。
屏幕上，我展示了一张色谱柱的简图。
[insertcolumn_schematic.gif]。
您可以看到，在色谱柱的进口和出口两端都有筛板[pointtofrits]。
所有这些区域都是杂质容易聚集的地方，从而可能限制流路。
例如，尤其在容易发生问题的进口端[pointtoitonscreen]，任何来自样品、流动相，或溶剂的小颗粒，甚至是微米级的颗粒，都可以阻塞在筛板处。
[insertfrits_compared.jpg]
作为比较，我们在这里有一张照片，对比了一个干净的筛板和一个堵塞的筛板。
Ron:
是的。
所以我们首先谈谈色谱柱进口端筛板的堵塞问题，这可能是进口端导致压力上升最常见的原因。
筛板是带有小孔的不锈钢盘片，这些孔是微米级的有2微米、1微米或者半微米，就它们本身而言，它们是非常有用的过滤器。
当然，它们也会被不同来源的微粒堵塞。
John:
这类压力上升通常是逐渐发生的。
换句话说，这种原因不可能导致数分钟内压力的明显上升，除非您的流动相或样品出现了非常严重的问题。
Ron:
对。
这种情况通常会在数天，数周，甚至数月内逐渐发生。
这就是为什么我们推荐保留一段时间内压力变化的日志的原因。
所以柱头故障引起的压力上升是一个我们将要解决的问题。
我们可以在任何一张ChemStation工作站的色谱图上看到压力信息。
John:
那么，这些微粒可能来自哪里呢？
Ron:
当然，一些微粒可能来自样品。
例如，如果您没有过滤您的河水样品，它里面就可能含有淤泥和微生物。
这些淤泥会聚集在您的色谱柱进口端筛板上。
John:
微粒的另一个来源可能是进样器的磨损，或者来自您进样小瓶密封隔垫的碎片。
Ron:
泵密封圈也是产生微粒的另一个来源。
月复一月的使用泵，最后您将不得不更换泵密封圈。
而且，在密封圈磨损的过程中，非常小的石墨填充聚四氟乙烯碎块，或您恰巧用到的其它什么泵密封圈材料的碎块，会通过您的系统流路，管路、脉冲阻尼器等等，最终停留在色谱柱进口端筛板处。
[showcigarettefilterinpurgevalveon1200…showblackenedfilter]
John:
流动相也可能是一个污染源。
例如，缓冲液制备中包括的许多人工移液步骤。
每一个步骤中都有可能引入微粒。
柱筛板是常见被堵塞的地方。
这种类型堵塞的影响是渐进的，一般不会突然发生。
堵塞色谱柱的微粒有诸多来源：
-样品，
-仪器部件的磨损（如转子密封圈和泵密封圈），
-磨损的进样小瓶盖密封隔垫碎片，
-还有溶剂和缓冲液。
反冲色谱柱
Ron:
现在我们假设色谱柱进口端筛板已经被堵塞，色谱柱为微粒污染部位。
我们如何去除这些微粒，使色谱柱恢复其初始的压力状态？
一个方法是反冲色谱柱。
John将会在我详细讨论这些步骤时帮我做演示。
[Ronspeaks,whileJohndemonstrates]一些（但不是所有）色谱柱可以反冲。
假如堵塞发生在色谱柱进口端筛板处，您可以用液体反冲色谱柱，这可能会逐出或移除一些微粒。
一些色谱柱的两端装有相同孔径的筛板。
在这种情况下，您可以从系统上取下色谱柱，并把它的出口端连到泵后的进口管上[demonstrate]。
向色谱柱中泵入水、乙腈或者流动相，一段时间后，一些，也许全部堵塞进口端筛板的微粒会被除去。
对于任何有一个箭头指向某个方向的色谱柱，一定要注意查看这根色谱柱附带的手册或者数据页，确定这根柱子是否可以反冲。
如果其手册或数据页上没有关于反冲的任何说明，请致电制造商咨询该色谱柱是否可以进行反冲。
这一点非常重要，原因是一些色谱柱制造商实际上会在柱进口端使用了较大孔径的筛板，而在柱出口端使用较小孔径的筛板。
如果制造商在色谱柱进口端使用了2微米孔径筛板，而在另一端使用了0.5微米筛板，同时您的色谱柱填料粒径是亚2微米的（1.8或1.9微米），这是当前色谱柱常见的一种配置。
如果反冲这种色谱柱，一些1.8或1.9微米的填料颗粒，尤其是粒径分布中更小的一部分，将非常容易进入或者穿过进口端筛板。
因此，在进行任何反冲前了解色谱柱进口端筛板的孔径非常重要。
假如色谱柱可以反冲，您仅需要注意几件事情。
首先，当您进行反冲时，不要把色谱柱连接到检测器上[indicate]。
显然您并不希望反冲出的任何微粒进入到检测器流通池中并可能堵在那里。
您应该把色谱柱的进口端导入一个烧杯中，收集反冲出的溶剂。
[JohndemonstrateswhileRontalksvoiceover].
有几件其它您不要做的事情：
不要采用极高流速，至少开始时不能这样[showlowflowratestartonChemStationscreen,indicateprocess,thenincreasingflowrate…usingchemstationwindow,whileRonspeaks]，因为色谱柱在最初是阻塞的，我们的目的是为了清除这些微粒。
因此您应该从一个相当低的流速开始反冲，当您观察到微粒被逐出，压力下降后，您可以提高流速，在较高的流速下冲出剩余的微粒。
值得注意的是有时微粒会紧紧堵在筛板孔内，也就是说微粒堵在筛板深层，这就不太容易清除它们。
在这种情况下，如果您不能通过这些操作把压力降下来，那么很可能您要舍弃掉这根柱子，并给您的仪器配备一根新色谱柱。
对于微粒污染导致问题的色谱柱，您可以通过反冲来修复它。
只有一些，并不是全部色谱柱都可以反冲。
谨记要查阅您的色谱柱说明书，或者在不能确定时联系您色谱柱的制造商。
反冲色谱柱时，您可以从系统上取下色谱柱，并把它的出口端连到泵后的进口管上。
泵入水、乙腈或者您采用的流动相，使其通过色谱柱，去除堵塞筛板的微粒。
反冲时不要把色谱柱与检测器连接。
此时您应该把色谱柱的进口端引入一个烧杯，用它收集反冲出的溶剂或者水。
不要使用高流速。
使用低的初始流速，需要时再提高流速去除堵塞的微粒。
过滤、离心和保护色谱柱
Ron:
我们应尽力防止微粒进入色谱柱进口端。
这张简图说明了我们应该如何装备系统以防止微粒进入。
[insertpressure_equation.gif]
给您的系统接入在线过滤器[pointto“filter”onimage]，将会清除这些微粒[backtospeakers]。
目前有许多零死体积或低死体积的在线过滤器可供选择。
这是我们推荐的可用于1290InfinityLC上的过滤器[holdup]。
多年前，当色谱柱进口端筛板堵塞后，我们建议用户更换新的筛板，甚至更换整个柱进口端部件。
但是现在，微米级颗粒色谱柱的填料如此高效，假如您移动了一个进口端部件，您可能会破坏填充柱床，柱子的高效性将不复存在。
所以现在我们已不再推荐移开柱端部件去更换堵塞的筛板了。
John:
另一个保护分析柱的措施是在进样器和分析柱之间连一个保护柱[insertpreventing_pressure.jpgagain,pointtoguardcolumn]。
保护柱可以通过两种途径起作用：
1）阻止微粒到达分析柱柱头；2）捕获不需要的可能驻留在柱床上引起压力升高的化学成分。
通常保护柱中的填料与您分析柱中的填料是相同的类型，甚至是完全相同的填料。
但是保护柱是一段很短的小柱，更换费用更低。
当前有许多类型的保护柱，有一些与分析柱间连有一小段小体积管线[show]，还有一些直接与分析柱集成连接，这样两者之间实际上就不存在死体积了。
使用保护柱的基本理念是把它作为一个机械和化学的过滤器。
Ron:
为了防止污染物积聚，您应该过滤缓冲液、溶剂和样品，以除去其中的微粒，防止它们到达色谱柱。
现在有多种过滤器可供选用：
1）不同直径和材质的针头式过滤器[showbeingplaced]；2）可在自动进样器样品小瓶中实现过滤操作的微型非针头式过滤器[showbeingused]；3）在可重复使用的过滤器件中使用的可替换单膜过滤器[demonstrate]；4）较少使用的玻璃、纸质和陶瓷材料过滤器。
当使用薄膜过滤器时，一定注意膜聚合物材料要与流动相和样品溶剂兼容[showimageofpaneloffilterthatindicatescompatability]。
否则，过滤器中溶解下来的膜材料会进一步污染您的系统或样品。
Ron:
另一种去除样品中微粒的方法是离心。
将您的样品放入离心管中，以4000rpm的速度离心大约4-5分钟，大部分微粒将会被甩到管底。
要小心转移“沉渣”上面的澄清样品溶液，避免微粒返回以污染溶液。
John:
好，谈完过滤，我们现在来谈一谈您的色谱柱如果发生了堵塞的情况。
我们首先要做什么？
要装备您的系统，防止微粒进入柱进口端。
在线过滤器可以帮助您清除污染微粒。
保护柱也是防止您的分析柱堵塞的重要工具。
目前有许多类型的过滤器和缓冲液可以选用，以帮助您减少可能引起堵塞的微粒：
1）不同直径和材质的针头式过滤器；
2）允许在自动进样器样品小瓶中实现过滤操作的微型非针头式过滤器；
3）放置于可重复使用的过滤器件中的单膜过滤器；
4）较少使用的玻璃、纸质和陶瓷材料过滤器。
当使用膜过滤器时，一定要确保膜聚合物材料与流动相和样品溶剂兼容。
离心是去除样品中微粒的另一种方法。
化学污染
Ron:
柱头的不锈钢筛板通常是惰性的，至少对于大多数化学物质是这样。
所以，它们通常不会与您的样品或流动相有化学相互作用，这里发生的主要是物理性质的堵塞。
但是柱填料是化学上高表面积的吸附剂，键合相填料会保留化学物质。
这也是我们把它们用于色谱分析的原因。
John:
遗憾的是，一些物质会被强保留，尤其在柱头处，它们会塞住填料并导致色谱柱堵塞，从而进一步导致压力升高。
Ron:
假如堵塞不是由于筛板处的微粒引起的，那么它很可能是您填料的化学污染造成的。
如前所述，污染物最可能在柱上端的进口端填料处积聚，因为那是样品和流动相最先接触色谱柱的地方。
所以像聚合物材料、高分子材料、蛋白质和与硅质有强烈相互作用的碱性化合物等任何材料，一旦与色谱柱紧密结合，问题大都会发生在柱前端。
处理这些污染物的最好方法就是找到既能溶解它们，又不影响色谱柱性能的溶剂。
显然，您也不会希望使用一个强溶剂或者一个碱性溶剂清洗柱子时，却导致填料溶解或引起其它问题。
所以您应该使用比您的流动相洗脱能力稍强的溶剂。
接下来让我们看看我们如何完成这个实验。
首先是我们以前讨论过的反冲。
这是最好的方法，假如您想冲洗色谱柱，并且这根色谱柱可以反冲，您就可以反向从柱进口端把任何化学污染物反冲掉。
我们这样做的原因是由于污染物常常与柱顶端的填料非常牢固地结合。
也就是说，您并不能很容易地去除它们。
当您希望通过正向冲洗，使化学污染物穿过整个色谱柱时，这将需要非常长的时间，您也需要耗费相当多的溶剂，并且您的色谱柱很长一段时间不能使用。
但如果您反冲色谱柱，由于污染物就在柱头上，把它们逐出色谱柱只需要很短的一段距离。
但我还是要再一次提醒您，只有对可以反冲的色谱柱才可以进行反冲操作。
John:
我最常听到的问题之一是冲洗净化色谱柱需要多少溶剂。
Ron:
是的。
我们使溶剂通过色谱柱的常规用量与我们称谓的“柱体积”相当。
一个柱体积是当把所有旧有溶剂从色谱柱中冲出来时所需溶剂的量。
它是柱的死体积，或者说是把一个在柱上不保留的组分冲出色谱柱时需要的溶剂体积[asRonspeaks,showJohnlookingathiscolumnandthenmeasuringout15mLofsolvent]。
对于柱长15cm，内径4.6mm的典型色谱柱，其柱体积是1.5mL。
[showcolumn_volume.gifonscreen]这里有一个计算您使用的色谱柱柱体积的方法。
一般来讲，对于ZORBAX色谱柱，我们把填料总体积的60%作为其孔隙体积。
这样您就可以算出，假如您希望使用10倍柱体积的溶剂，那就是15mL。
所以为了安全起见，上述是我对冲洗实验各步骤的推荐意见。
我们许多人经常使用反相色谱，其溶剂“A”常用缓冲盐水溶液，溶剂“B”通常是与水可以混溶的有机溶剂，如甲醇和乙腈。
当我们开始反冲实验时，我们务必记住不要把有机溶剂直接加到缓冲液系统中。
因为如果我们那样做了，缓冲盐会很容易在色谱柱中沉淀析出，那样就会导致更严重的背压问题。
色谱柱填料的化学污染不同于微粒污染—它更难去除。
柱前端的化学污染最常见。
处理这种污染物的最好方法就是找到既能溶解它们，又不损伤色谱柱填料的溶剂。
假如您的色谱柱可以反冲，您首先应该考虑从柱头反冲掉这些化学污染物。
您需要足量的溶剂去冲洗净化色谱柱。
我们用“柱体积”来衡量所需溶剂的量，柱体积可以用公式来计算。
一般来讲，我们推荐先用10倍柱体积的溶剂冲洗。
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清洗色谱柱
所以我们首先要做的就是用您正用的流动相冲洗色谱柱[indicatesolventbottleslineduponbench:
Methanol,75%Acetonitrile/25%Isopropanol,100%isopropanol,100%methyleneChloride,100%Hexane]，但是流动相中不要含有缓冲盐。
好，现在我们的柱子里是水和乙腈。
下一步是用100%的有机溶剂冲洗色谱柱，当然，也是反冲。
通常，假如您正使用的是甲醇，您应该首先使用100%甲醇冲洗，然后换用比它的洗脱能力稍强的有机溶剂。
在这种情况下，乙腈会是一个很好的选择。
您会看到，随着我们使用了洗脱能力更强的溶剂冲洗色谱柱，一些化学污染物就开始更容易被冲洗或去除了。
假如乙腈的洗脱能力还不够强大，系统压力没有开始下降，那么您可以采用更强的溶剂。
当您使用了乙腈以后，我们来看看洗脱溶剂序列并选择要用到的更强的一种溶剂。
下一个溶剂我推荐可以在您上一步所用的溶剂中加入异丙醇。
异丙醇（IPA）是许多非极性分子的良好溶剂，它也与许多常用的有机溶剂如乙腈和甲醇混溶，同时它与水也可以混溶。
所以我下一步用75%乙腈/25%IPA的混合溶剂冲洗。
现在当我们冲洗时，我们希望看到压力正在随着冲洗下降。
假如使用这些溶剂中的任何一种能使压力下降，那可能就足够了。
您就不需要再进一步尝试剩余序列的溶剂了。
John:
这个过程是非常艰苦的。
Ron:
是的，是这样。
还有其它一些事情是您需要注意的。
当您把不同溶剂与异丙醇混合后，您应当了解IPA本身的黏度非常高，使用这种混合溶剂冲洗色谱柱时压力会比较高。
所以您不能使用很高的流速冲洗，至少最初，当您刚开始反冲实验时不要使用。
假如您HPLC的常规流速是1mL/min，您开始反冲时可能只能用到0.25mL/mim，或者类似的流速。
John:
好，现在您已经使用了甲醇、乙腈和75%乙腈/25%IPA冲洗色谱柱。
接下来会如何？
Ron:
假如问题仍没有解决，那么我将使用100%异丙醇冲洗[indicatebottlesonbenchagain]。
当然您只能采用非常低的流速，因为异丙醇的黏度是甲醇的3-4倍，所以，如果您采用1-2mL/min的流速，您会观察到系统的极大的压力差。
大多数情况下，如果这是一个化学污染，并且化学污染不是特别高分子量物质造成的，使用上述溶剂冲洗应该就可以解决压力问题了。
假如是非常非常低极性的组分堵塞了色谱柱，那么我们最后还有两种溶剂可以使用。
一个是二氯甲烷，一个是己烷。
显然，我们要分别使用10倍柱体积的这两种溶剂冲洗色谱柱，同时观察压力变化。
假如压力在使用了全部系列溶剂后仍然很高，那么这根色谱柱可能就很难再恢复了。
John:
好。
通过这整个过程的实验，我们容易发现为什么许多人往往倾向于更换他们的色谱柱而不是反冲再生它。
Ron:
是的，或者像我们以前讨论过的，许多人使用保
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