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WB实验问题

WesternBlot问题指南

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2011-05-1308:

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根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！

）;1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？

解答：

《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，

根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！

）;

1.参考书推荐

A.对初学者看什么资料比较好？

解答：

《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。

2.针对样品的常见问题

B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。

是什么原因？

蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

解答：

怀疑是样品问题，可能是：

1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。

同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。

对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？

解答：

当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

D.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

解答：

如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

E我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

解答：

你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。

F.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？

积层胶的浓度又该用多少？

这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？

解答：

260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，StackingGel3.5％。

G.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

解答：

可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。

一般地，超载30％是不会有问题的。

如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。

H.蛋白变性后可以存放多久？

解答：

－80℃，一两年没有问题。

最关键两条：

不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

I.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

解答：

上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

J.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：

不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点．

K.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

解答：

WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。

开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。

要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。

所以拿到好的结果不容易。

L.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？

还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？

浓度如何？

效果是不是比BSA好一点？

解答：

必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。

还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。

如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。

M.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

解答：

做200kd蛋白的WesternBlot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

N.有什么方法可以提高上样量？

解答：

可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。

O.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？

解答：

如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBlot就可以了。

如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。

42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

P.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

解答：

上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。

Q.一抗，二抗的比例是否重要？

解答：

比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

3.抗体

R.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot，其二抗有何要求？

解答：

对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

S.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？

我用的ELL+plus试剂盒显色。

转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

解答：

不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。

我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。

至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。

一抗当然可以过夜，如果你想所短WesternBlot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。

至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：

1500；二抗1：

20000试试。

另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！

T.免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？

解答：

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。

如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。

（限于单抗）

U.WesternBlot中抗体的重复应用问题

解答：

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。

稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

4.滤纸、胶和膜的问题

V.NC膜\PVDF膜\尼龙膜怎样鉴别？

解答：

尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言：

尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。

就温度适应性而言：

尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。

就韧性而言：

尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。

就重复性而言：

尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

W.在做WesternBlot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

X.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？

解答：

可以。

AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？

解答：

这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？

解答：

用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。

CC.采用tanksystem有什么讲究？

解答：

建议低电压，长时间，（一般tankSystem用衡压好点），如28V14－16hrs。

DD.做HSPWESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？

解答：

这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和IHC。

EE.膜一般要如何处理？

解答：

一般用甲醇泡泡就可以了。

FF.如果是6×8转印膜，要加多少一抗？

解答：

一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

GG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

解答：

无要求。

HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？

是有的成分不对吗？

解答：

没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。

过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。

如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。

脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？

解答：

如果是用的是半干转，顺序为：

阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。

滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。

绝对禁忌：

上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

解答：

这么广的分布不好转移，一般建议：

21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V，3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd用7%SDS－page，48V10hrs－16hrs。

KK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

解答：

可以考虑：

转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液