显微镜成像原理.docx

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显微镜成像原理

显微镜成像原理

光学显微镜的原理

发布时间：

10-05-15

来源：

仪表展览网

点击量：

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　　将微小物体或物体的微细部分高倍放大，以便观察的仪器或设备。

它广泛应用于工农业生产及科学研究。

生物学和医学工作者在业务中也经常使用显微镜。

大致分为光学显微镜和电子显微镜。

　　光学显微镜　即以可见光为光源的显微镜。

普通的光学显微镜在结构上可分为光学系统和机械装置两个部分。

光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。

机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分（图1）。

其基本光学原理如图2,图中左边小的凸透镜代表短焦距的一组透镜，称物镜。

右边大的凸透镜代表长焦距的一组透镜，称目镜。

被观察的物体（AB）放在物镜焦点（f1）稍外的地方。

物体的光线通过物镜后在目镜焦点（f2）稍内方形成一个倒立的放大实像（B'A'）。

观察者的眼睛通过目镜将该实像（B'A'）进一步放大为一个倒立的虚像（B″A″）。

　　目镜位于显微镜筒的上方，一般由两个凸透镜构成。

它除了进一步扩大物镜所形成的实像之外，也限制了眼睛所观察的视野。

按放大率分,常用目镜有5倍、10倍和15倍三种。

　　物镜一般位于显微镜筒的下方，接近所观察的物体。

由8～10片透镜组成。

其作用一是放大（给物体造成一个放大的实像）,二是保证像的质量,三是提高分辨率。

常用物镜可按放大率分为低倍（4×）、中倍（10×或20×）、高倍（40×）和油浸物镜（100×）。

多个物镜共同镶在换镜转盘上，可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。

　　显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数，如目镜为10倍，物镜为40倍,则放大倍数为40×10倍（放大400倍）。

优良的显微镜可放大2000倍，可分辨相距1×10-5cm的两点。

　　当白光通过凸透镜时,波长较短的光（蓝紫色）,其折射度大于长波长的光（红橙色），因此，成像时在像周出现各色光谱围绕,并且有一圈蓝色或红色的辉光,这种颜色上的缺陷称为色差。

由于光线进入（和离开）透镜镜面各部分的角度不同，从透镜四周透过的光线与从透镜中心透过的光线相比，其折射角度较大。

因此，成像时在像周出现模糊而歪曲的影像。

这种成像面弯曲的缺陷称为球面差。

一系列形状、结构和距离不同的凸和凹透镜组互相配合，便能最大限度地纠正色差和球面差，形成一个明亮、清晰而准确的影像。

这就是目镜或物镜分别由一组透镜构成的缘故。

这种透镜称为平场消色差透镜。

　　光线从一种介质（如空气）投射到另一种较为致密的介质（如玻璃）中时会弯向“法线”（与介质交界面垂直的一条线）,如图3中的BOA线。

光线由致密介质（玻璃）进到不致密介质（空气）中时会偏离“法线”，如AOB线（图3a）。

当光线穿过聚光镜玻璃（折射率为1.51）进入空气时同样会偏离,向外折射,因此进入物镜的光量减少很多，像的分辨力也降低。

使用100倍物镜时,如果在物镜和盖玻片之间充以油液（折射率同样为1.51）以隔绝空气，则光线几乎可以不折射地进入物镜，这就增加了像的亮度和分辨率。

这种物镜称为油浸物镜（图3b）。

　　聚光器位于显微镜台的下方，可会聚来目光源的光线，将光量集中于标本，使标本受到光强适度的均匀照射。

聚光器的下端装有孔径光阑（光圈）以控制光束的粗细。

　　普通光学显微镜的照明光源位于聚光器的下方，为特制的照度均匀的强光灯泡，并且配有可变电阻，可以改变光线的强度。

　　由于普通光学显微镜的光源光线自镜体下方向上透射，通过聚光镜、物镜，达到目镜，因此在医学及生物学研究中必须将被观察的样品切成能透过光线的、厚约6μm的薄片，并且要进行染色以显示不同的组织和细胞等细微结构。

整个加工过程称常规组织制片技术，包括选取适当的组织材料经甲醛（福尔马林）液固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，用切片机将组织切成薄片裱在玻璃片上，再经苏木素—伊红染料着色，最后将组织玻片封固在光学树脂胶内。

制好的组织玻片可长期保存。

　　显微镜的目镜和物镜安装在镜筒的两端，它们的距离是固定的。

将组织玻片放在载物台上，旋转粗调螺旋使载物台接近物镜。

组织切片进入物镜第一焦平面，目镜内即可见标本内的组织影像。

然后用细调螺旋使目镜内的影像清晰即可进行观察。

改换放大倍数时就要调换目镜或物镜。

　　医学和生物学常使用的光学显微镜　有下列12种：

　　暗视野显微镜　在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器（图4）,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。

因此视野是暗的，视野中直径大于0.3μm的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。

甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。

因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。

　　实体显微镜　由双筒目镜和物镜构成。

放大率7～80倍。

利用侧上方或下方显微镜灯照明。

在目镜内形成一个直立的放大实像，可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片。

　　荧光显微镜　在短波长光波（紫外光或紫蓝色光,波长250～400nm）照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长400～800nm），这种光称荧光。

某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。

但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。

荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源经过激发滤光片（此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光）过滤后射向普勒姆氏分色镜。

分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。

染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。

目镜下方安置有屏障滤片（只允许特定波长的荧光通过）以保护眼眼及降低视野暗度（图4）。

荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的100倍。

30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。

如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。

40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。

在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。

　　偏光显微镜　从光源发出的光线通过空气和普通玻璃时，在与光线垂直的平面内的各个方向以同一振幅进行振动并迅速向前方传递，这是光的波动性原理。

空气与普通玻璃为各向同性体，又称单折射体。

如果该光源的光通过一种各向异性体（又称双折射体）时，会将一束光线分为各只有一个振动平面的，而且振动方向互相垂直的两束光线。

这两束光线的振动方向、速度、折光率和波长都不相同。

这样只有一个振动平面的光线称偏振光。

偏光显微镜即利用这一现象而设计。

偏光显微镜内，在物镜与目镜间插入一个检偏镜片，光源与聚光器间镶有起偏镜片，圆形载物台可以作360°旋转（图5）。

起偏与检偏镜片处于正交检偏位时，视野完全变黑。

将被检物体放在显微镜台上。

若被检物为单折射体，则旋转镜台，视野始终黑暗。

若旋转镜台一周，视野内被检物四明四暗，则说明被检物是双折射体。

许多结晶物质（如痛风结节中的尿酸盐结晶、尿结石、胆结石等），人体组织内的弹力纤维、胶原纤维、染色体和淀粉样原纤维等都是双折射体，可借偏振光显微镜术检验，进行定性和定量分析。

　　位相显微镜　又称相差显微镜或相衬显微镜。

普通光学显微镜之所以看不见未染色的组织、细胞和细菌、病毒等活机体的图像，是因为通过样品的光线变化差别（反差）很小。

标本染色后改变了振幅（亮度）和波长（颜色），影响了反差而获得图像。

但是染色会引起样品变形，也可使有生命的机体死亡。

要观察不染色的新鲜组织、细胞或其他微小活体必须使用位相显微镜。

位相显微镜的原理是两个光波因位相差而互相干涉，出现光波强弱和反差的改变而成可见影像。

点光源发出的光线可以表现为正弦波图形（图6a）。

两个波峰间的距离为波长,波的振幅表示光的亮度（振幅大、亮度高）。

设想同一光源发出的两条光波,分别同时通过空气及某种透明介质。

在通过一定厚度的某种透明介质时，光波的速度就会降低，但是光的亮度未变。

光波在通过该透明介质后比一直在空气中前进的另一条光波迟滞了波长，因而两条光波出现了位相的变化（位相差）。

但人眼不能分辨这两条平行光线的位相差。

如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱。

如果一条光波虽然迟滞了一个波长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强。

　　位相显微镜的基本结构与普通光学显微镜相同。

不同之处在于：

①物镜镜头上面，在物镜第二焦平面装有一块圆盘状的位相板（图6b）。

②聚光器下面，在聚光器第一焦平面装有环形光束，光束上刻有狭窄的缝隙可通过环形强光（图6c）。

如图6d所示，环形光束A点发出的光线经过聚光器后成为平行光线。

光线通过载物台上的样品时，因样品内各个质点（如b点）的折射率不同而受到干涉，发生衍射,即分为未偏向波（实线）和偏向波（虚线）。

未偏向波通过物镜聚焦于位相板A'点上成像，然后通过位相板，均匀地分布在标本像平面上成为背景。

偏向波通过物镜后从位相板A'点周围通过位相板同样聚焦在像平面的B'上。

换句话说，未偏向波和偏向波是分别通过位相板的不同部位。

在位相板上不同的区域涂有不同的涂层，可以分别改变未偏向波或偏向波的速度和亮度，由此两种光波出现了位相差，差了半个波长或一个波长，它们在像平面的合波就出现明暗对比，样品内的各个细节也就能看得见。

　　总之，位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。

　　倒置式显微镜　普通显微镜镜的物镜头方向向下接近标本。

倒置式显微镜的物镜镜头则处于垂直向上的位置，因此目镜和镜筒的纵轴与物镜的纵轴呈45度角。

载物台面积较大，在物镜上方，载物台上方有一个长焦距聚光器和照明光源。

物镜和聚光器可装配位相显微镜的附件。

放大率16～80倍。

组织培养瓶和培养皿可以直接放在载物台上，进行不染色新鲜标本及活体、细胞的形态、数量和动态观察。

可进行多孔微量生物化学及免疫反应平板的结果观察。

倒置式显微镜可换用普通亮视野光学镜头;可装配偏振光、微分干涉差、荧光附件进行观察。

　　微分干涉差显微镜（DIC）　又称干扰或干涉显微镜。

能看到和测定微小的位相变化，与位相显微镜相似，使无色透明的标本具有明暗和颜色的变化，从而增强反差。

在普通光学显微镜的基本结构上安装偏光和干涉部件，以及360°旋转载物台。

它又利用偏振光的干涉原理。

如图7所示,在光源上方安置有起偏镜片和光束分解棱镜。

从起偏镜片出来的直线偏振光通过光束分解棱镜后，分成互相垂直振动的两条直线偏振光。

两条光线经聚光器折射后射向样品。

因样品内各个质点的折射射率不同，部分光波的位相改变及因干涉而发生横向偏移。

两条光线通过物镜后经第二组光束分解棱镜相合并，由检偏镜发生干涉。

终末像的每一个点是由物体上同一点的两个互相重叠的不同图像构成的一种混合像，从而使肉眼得以辨识。

　　微分干涉差显微镜同样可以观察到在普通亮视野中看不见的无色透明物体,可以观察细胞、细菌等活体,而且影像呈立体感，较位相显微镜的影像更细致、更逼真。

可用它对活细胞的各个部位作更精细的研究。

如果用白光照明，不同位相表现为各种颜色，转动载物台，颜色会发生变化。

单色光照明产生明暗反差，各种成分呈现不同的对比度。

微分干涉差显微镜又可以作为一种高度精密