血液检验的一般检验技术第一次.docx

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血液检验的一般检验技术第一次

第一章血液检验的一般检验技术

实验一血液标本采集

一、皮肤采血法

【目的】掌握皮肤采血法（collectionofskinpunctureblood），了解不同部位采血对检验结果的影响、

【原理】采血针刺破毛细血管后血液自然流出，用微量吸管吸收一定量的血液。

【器材】

1.一次性消毒采血针（图1-1）。

2.20μl微量吸管（应校准后使用）或一次性微量吸管、胶乳吸头。

3.试管、试管架。

4．2ml吸管、吸耳球。

5.75%（V/V）乙醇脱脂棉球或碘酊脱脂棉球。

6.无菌干脱脂棉或滤纸。

【试剂】

1.洗涤液3管（蒸馏水、95%乙醇、乙醚）。

2.生理盐水。

3.75%乙醇或碘酊。

【标本】末梢血

【操作】

1.准备材料仔细阅读患者申请单，决定采血量。

准备每个试验所需的试管。

例如取试管1支，加入2ml生理盐水。

取微量吸管与胶乳吸头相连，检查连接处是否漏气，或取一次性微量吸管备用。

2.选择采血部位婴幼儿选择足跟采血，其他患者选择第三、四手指或耳垂（图1-2）。

3.按摩皮肤轻轻按摩皮肤或用热毛巾温暖皮肤，使局部自然充血。

4.消毒皮肤用75%乙醇脱脂棉球或碘酊脱脂棉球擦拭采血部位的皮肤，待干。

5.针刺皮肤用左手拇指和示指固定采血部位使其皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次性消毒采血针自指尖内侧迅速刺入（图1-3），深度2~3mm，立即出针。

6.拭去第1滴血待血液自然流出或稍加压力流出后，用干脱脂棉擦去第1滴血。

7.吸血血液自然流出时，用微量吸管吸血至10μl刻度，然后用干脱脂棉压住伤口止血。

如血流不畅，可以用左右自采血远端想指尖稍施压，使血液流出。

8.止血采血完成后，用干脱脂棉压住采血部位进行止血，若有可能，贴上创可贴。

9.稀释血液用干脱脂棉擦净微量吸管外部后，将吸管伸入装有生理盐水的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，并用上清液冲洗管内余血3次。

【注意事项】

1.采血前准备在采集标本前，应使被检者尽量保持平静，减少运动。

住院患者应尽量在早晨卧床时采血。

尽量避免药物及饮食对检验结果的影响。

在进行多项检查室，采集血液标本的顺序是血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定和白细胞计数与分类。

2.选择采血部位所选择采血部位的皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。

半岁一下婴幼儿由于手指小，可自拇指、足趾或足跟内、外侧缘采血；严重烧伤者可选皮肤完整处采血。

3.消毒皮肤因本实验具有创伤性，必须严格按无菌技术操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染，最好用一次性采血针，皮肤消毒后，应待乙醇或碘酊挥发后采血，否则流出的血液不易成滴。

4.针刺皮肤进、出针要迅速，伤口要有足够深度。

5.拭去第一滴血因第一滴血混有组织液，应擦去。

如血液不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。

如采血用于自动血液分析仪，最好以优质无菌纸巾擦血，以免棉纤维混入，造成仪器堵孔。

6.吸血与检测微量吸管应定期进行校准，容量误差≦1%。

血液充入管内的速度不宜过快，避免出现气泡，血液弯月面达到刻度线处即可。

标本采集后应及时测定，最好在2h内完成，不宜在冰箱内存放。

实验二改良牛鲍计数板的使用

【目的】掌握改良牛鲍计数板（improvedNeubauerhemocytometer）的使用方法。

【原理】一定倍数稀释的血液或体液，混匀后滴入具有固定体积和精密划分刻度的改良牛鲍计数板中，在显微镜下对所选择区域中的细胞进行计数，再乘以稀释倍数，即可换算成单位体积内的细胞数。

【器材】

1.改良牛鲍计数板及盖玻片改良牛鲍计数板为优质厚玻璃制成。

每块计数板由“H”型凹槽分为2个同样的计数池（图1-8）。

计数池两侧各有一条支持柱，较计数池平面高出0.10㎜。

将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10㎜的计数池。

计数池内划有长、宽各3.0㎜的方格，平均分为9个大格，每个大格面积为1.0平方毫米，容积为0.1立方毫米（μl）。

在这9个大格中，中央大方格用双线分为25个中方格，其中位于正中及四角的共5个中方格是红细胞、血小板计数区。

每个中方格又用单线分为16个小方格。

位于四角的4个大方格是白细胞计数区，它们分别用单线划分为16个中方格（图1-9）。

2.试管、试管架。

3.吸管、吸耳球。

4.微量吸管、胶吸头、干脱脂棉。

5.绸布。

6.玻棒。

7.显微镜。

【试剂】

1.白细胞稀释液。

2.红细胞稀释液。

【标本】抗凝血

【操作】

1.准备计数板先用流水冲洗计数板和盖玻片除去所有残留物，然后用乙醇洗涤，最后用绸布拭净，采用推压法从计数板下缘向前平推盖玻片，将其盖在计数池上。

2.稀释血液取试管2支，标明A、B，分别家白细胞稀释液0.38ml、红细胞稀释液2ml。

再各加抗凝血20μl、10μl，混匀备用。

3.充池充分混匀A液2~3min，用微量吸管或玻棒将稀释血液滴入计数板和盖玻片交界处，利用虹吸作用让液体顺其间隙充满计数池；再取B液，以同样方法在另一侧计数板充池。

4.静置计数板充池后应平置于桌面上静置3min,待细胞下沉。

5.计数先用低倍镜（10倍目镜和10倍物镜）观察，通过调节显微镜光栅减少光线进入量以便观察整个计数板的结构（大、中、小方格）及特征，同时观察血细胞分布是否均匀。

在充A液的计数池观察白细胞计数范围，在充B液的计数池用高倍镜（10倍目镜和40倍物镜）观察红细胞计数范围（图1-10）。

6.计数原则须遵循一定的方向逐格进行（图1-10），以免重复或遗漏。

对压线的细胞采用数左不数右，数上不数下的原则（图1-11）。

记录所数5个中方格的红细胞数和4个大方格的白细胞数。

【注意事项】

1.计数板

（1）保证计数板和盖玻片清洁：

操作中勿让手指接触计数板表面，以防污染，致使充池时产生气泡。

如使用血液充池，计数板和盖玻片使用后应依次用95%（V/V）乙醇、蒸馏水棉球擦拭，最后用清洁纱布揩净。

千万无用粗糙织物擦拭，以免磨损计数板上的刻度。

（2）当盖玻片盖在计数板上时，若两层玻璃之间见到彩色条带（Newton环），说明计数板和盖玻片清洁良好，否则应重新清洁计数板和盖玻片。

（3）改良牛鲍计数板在启用前后每隔1年都鉴定1次，以防不合格或磨损而影响计数结果的准确性，鉴定内容是：

①盖玻片检查：

包括厚度和平整度。

厚度检查使用千分尺对盖玻片的厚度进行多点测定，最少测9个区，每区测2点，要求区域间厚度差<2μm；平整度检查使用平面平晶仪检测盖玻片两表面的干涉条纹，其条纹细密均匀或微量弯曲即为符合要求；②计数池深度：

将微米级千分尺尾部垂直架在计数板两堤上，移动尾部微米级千分尺，多点测量计数池的高度误差应在±2%（±2μm）以内。

2.充池一次完成充池，如充池过少、过多、有气泡或出现任何碎片，应拭净计数板及盖玻片后重新操作。

3.静置计数板平放计数板，不能在充池后移动盖玻片。

白细胞和红细胞计数一般需沉淀2~3min,血小板应沉淀10~15min，血小板应沉淀10~15min,且需注意保湿，因沉淀时间过长会因稀释挥发造成计数结果不准确。

4.计数计数板中细胞如果严重分布不均，应重新充池计数。

计数红细胞和血小板用高倍镜，计数白细胞用低倍镜。

5.计数原则凡压线的细胞应按照数上不数下，数左不数右的原则，避免漏数或重复计数。

注意识别非细胞成分。

实验三红细胞计数

【目的】掌握显微镜红细胞计数（redbloodcell,RBC）的原理及操作方法。

【原理】用等渗稀释液将以一定倍数（200倍）稀释并充入计数池，在显微镜下计数一定区域的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量、

【器材】

1.试管、试管架。

2.2ml吸管、吸耳球。

3.微量吸管、胶乳吸头、干脱脂棉。

4.玻璃棒。

5.改良Neubauer计数板、盖玻片、绸布。

6.显微镜。

【试剂】红细胞稀释液：

无水硫酸钠2.5g，氯化汞0.5g，氯化钠1.0g，加蒸馏水至200ml。

溶解后加20g/L伊红溶液1滴，过滤后使用。

【标本】EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。

【操作】

1.加稀释液取小试管1支，加入红细胞稀释液2ml。

2.采血及加血用清洁干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，擦去管外余血，轻轻加至红细胞底部，再轻吸上层清液漱洗管2~3次，以洗净管腔内德残留血液，立即混匀。

3.充池充分混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放2~3min，待细胞下沉后于显微镜下计数。

4.计数用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个方格内的红细胞数。

5.计算

红细胞数/L=N×

×10×201×106≈N×1010=

×1012

【参考值】

【注意事项】

1.器材均须清洁干燥。

盖玻片、计数板、微量吸管应符合质量要求。

2.试剂红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质。

3.标本推荐EDTA-K2抗凝剂，浓度为1.5~2.2mg/ml血液。

4.稀释液及稀释倍数。

（1）稀释液要过滤，以免杂质、微粒被误认为细胞。

（2）如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。

（3）下列原因可造成稀释倍数不准确：

①稀释液和（或）血液加样量不准确；②吸血时吸管内有气泡；③未擦去吸管外余血；④血液加入稀释液后，吸管带出部分稀释血液；⑤稀释液放置时间过长，蒸发浓缩。

（4）红细胞数量明显增高时可适当加大稀释倍数；反之，则适当减少稀释倍数，稀释倍数可通过改变稀释液加样量和（或）血液加样量进行适度调节。

5.采血

（1）不能过分挤压采血部位，针刺深度必须适当。

采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。

采血速度不应过慢，否则容易造成血内有凝块，导致细胞减少或计数分布不均。

如出现凝块，则应重新采血，并应充分混匀血液和抗凝剂，且在充池前再次混匀。

（2）被检者应从直立位换成坐位15min后才采血。

坐位采血较仰卧位15min后采血的红细胞计数值高5%~10%；剧烈运动后迅速采血可使红细胞计数增加计数增加约10%；静脉压迫时间超过2min会使红细胞计数平均增高10%。

6．充池将细胞悬液注入改良Nebubauer计数板的过程称为充池。

充池前应将细胞悬液充分混匀，但要防止因剧烈震荡而破坏红细胞。

将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。

7.计数

（1）大小方格脮压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。

（2）红细胞在计数池中若分布不均要重新充池计数。

在参考范围数值内，2次红细胞计数相差不得超过5%。

（3）血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson分布（S=

），造成分布误差或计数域误差。

根据cv=1/m×100%推断，欲将红细胞计数误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数400个红细胞，因此要求计数5个中方格的红细胞。

（4）经红细胞稀释液处理后，白细胞和红细胞同时存在，通常红细胞计数时已包含白细胞。

在一般情况下，外周血中白细胞数仅为红细胞的1/500~1/1000，白细胞数量在正常范围时，对红细胞的影响可忽略不计，但如果白细胞数过高（>100×109/L）,则应对计数结果进行校正：

①实际RBC=计得RBC－WBC。

如红细胞为3.5×1012/L、白细胞为100×109/L时，患者实际红细胞应为3.41×1012/L；②在高倍镜下计数时，不计数白细胞。

白细胞体积比正常红细胞大，中央无凹陷，无草色折光，可隐约见到细胞核。

但在外周血中出现有核红细胞时，则难以区别。