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优化条件下过氧化氢降解壳聚糖的光谱学研究解读

第29卷,第1期光谱学与光谱分析V01.29,No.1,pp43-472009年1月SpectroscopyandSpectralAnalysisJanuary,2009

优化条件下过氧化氢降解壳聚糖的光谱学研究

林芳1’2,贾新刚1,雷万学1,李正军1,张廷有H

1.四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065

2.国家皮革质量监督检验中心,浙江海宁314400

摘要在最佳反应条件下制备过氧化氢对壳聚糖的降解产物,通过测定原料及降解产物(Mw1500

166.53kDa)的氮、碳含量,分析它们的红外光谱、核磁共振碳谱、x射线衍射谱及圆二色谱,考察各产物是

否保持其天然结构。

结果表明:

各降解产物与原料的碳含量,氮含量及脱乙酰度的最大相对偏差分别为

2.4%,2.3%与6.9%,且后两者随着反应时间的延长而减小;各降解样品的红外光谱及核磁共振碳谱与原

料壳聚糖的相似,说明降解过程几乎不改变原料的化学结构;经相同方法处理过的原料及降解产物在20=

lo.4。

和19.8。

处均存在X射线衍射峰,在210nrn处均存在一个负的圆二吸收峰,表明产物的固态结构与其

在溶液中的构象均没有发生变化。

说明在优化的降解条件下过氧化氢氧化降解没有改变壳聚糖的天然结构。

关键词壳聚糖;过氧化氢;降解反应;光谱分析;结构特征

中图分类号:

0433.1文献标识码:

ADOI:

10.3964/j.issru1000-0593(2009)01—0043—05

为原则,优化反应温度及过氧化氢的用量等因素,通过改变

引言反应时间在最佳条件下制备不同分子量的壳聚糖,测定原料

及降解产物的氮含量和碳含量,分析它们的红外光谱、核磁

壳聚糖的分子结构中存在大量游离氨基,是天然多糖中共振碳谱、X射线衍射谱、以及圆二色谱,考察在最佳的降少见的阳离子型高聚物,易被微生物降解而不带来环境污解条件下各产物是否保持其天然结构。

染,具有较好的生物相容性及良好的抗菌性,在工业、农业、

医学及生物工程等各个领域得到越来越广泛的应用,已被现1实验部分

代科学称为继糖、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质5大生命

要素之后的第6生命要素。

为满足其在各个方面的应用,壳1.1材料与方法

聚糖的分子量分布范围最好能达到3~4个数量级,因此,对壳聚糖,重均分子量为1.5×103kDa,脱乙酰度其进行适当的降解是首要的工作。

过氧化氢因具有价格低83.85%;购自济南海得贝海洋生物工程有限公司。

过氧化廉,环境友好,降解产物的后处理简易等优点,已广泛应用氢与其他化学试剂均为分析纯。

于纤维素,半纤维素,淀粉等多糖类物质的处理。

就其对壳重均分子量的测定参照文献[43的方法进行。

聚糖的降解而言,与酶降解法相比,存在的不足之处主要氮含量测定:

在带有BUCHIK-437消化系统和BUCHI有:

在反应过程中壳聚糖的分子结构及脱乙酰度均发生明显339蒸馏系统的BUCHI全自动定氮仪上进行。

在消化管中的变化,分子中可能出现羧基,分子问可能产生交联[1]。

曾加入约0.2ge精确至0.0001g)样品,0.3g(精确至0.01g)有报道表明,当反应时间从0.5h增加到4h时,壳聚糖的硫酸铜与3g(精确至0.01g)硫酸钾,10lTlL浓硫酸控制消氮含量及脱乙酰度分别从7.36%与54%增加到8.39oA与化系统的温度为370℃,消化时间为2.5h,将得到的绿色或91%[2],当壳聚糖的分子量从498kDa降低到1.9kDa时其蓝色清亮透明溶液在蒸馏系统中进行氮含量测定。

羧基含量达到2.11%[1],且在分子链间将产生交联,产物变碳含量测定:

在PerkinElmerLiquidT()C总碳含量测定成棕黄色甚至黑褐色CsJ。

壳聚糖天然结构的变化必然导致其仪上进行。

配制0.2g・L_1的壳聚糖HCI(0.0025tool・特性的改变,影响了对这一很有前景的降解方法的进一步研L1)溶液,测定样品的总有机碳含量。

究及应用。

基于以上问题,本实验以保持壳聚糖的天然构象红外光谱分析:

在PerkinElmerSpectrumOne光谱仪上收稿日期:

2007-09-28.修订日期:

2007—12—18

基金项目:

教育部博士点基金项目(20050610047)和国家自然科学基金项目(20576083)资助

作者简介:

林芳,1980年生,I匹t)al大学轻纺与食品学院博士生*通讯联系人e--rrmil:

suli—zhangtymail@163.C01TI万方数据

光谱学与光谱分析

第29卷

用KBr压片法测定各样品的红外光谱。

核磁共振碳谱分析:

将样品制成盐酸化壳聚糖后在

BrukerAV

lI一400MHz核磁共振谱仪上以D2()为溶剂测

定。

X射线衍射分析:

以Cu为阳极钯,在Philips

X’Pert

Pro

MPDX衍射仪上对各样品进行x射线扫描。

根据参考文献E5]计算样品的结晶度。

圆二色谱分析:

将原料及待分析的样品溶解在0.025

tool・L_1HCl溶液中,用J一500C(JapanSpectroscopicCo.,

Ltd.,Tokyo,Japan)在15℃测定各样品的圆二色谱。

根据以下公式计算样品的摩尔椭圆率[胡:

[胡=CD信号×结构单元的相对分子质量(167.2Da)/[样品浓度(nag・mL啊1)×样品池的宽度(o.1crll)]。

1.2壳聚糖的降解

将0.5g壳聚糖及40

mL

1.5%的醋酸溶液加入反应器

中,水浴振荡2h。

待样品完全溶解后加入3%Hz鸭9.2mL,控温50℃,调节不同的反应时间制备不同分子量的壳聚糖。

反应结束后,加入少量NaH双)。

除去残余的Hz()2,用10%NaOH调节体系的pH值至9.0析出产品,用蒸馏水充分洗涤沉淀物至中性,50℃真空干燥48h即得反应产物。

2结果与讨论

2.1样品的氮含量。

碳含量及脱乙酰度

表1表明原料及各降解产物的分子量,氮含量,碳含量及脱乙酰度。

Table1

Molecularparametersofinitialchitosananddegradedchitosa璐nnderdifferentreactiontime

5为重均分子量

目前,红外光谱已广泛应用于分析计算壳聚糖样品的脱乙酰度(degree

of

deaeetylation,DD)[6’7]。

本文以各样品的

红外吸收光谱为依据,参照文献[8]计算相应的DD值。

实验证明,甲壳素或壳聚糖在1320与1

420

cln-1处的吸收仅与

样品的组分相关,而不受样品的处理方法、所处的状态及其二级结构的影响;根据公式DD=100一(31.92A1sm/A1t2I)一12.20)计算样品的脱乙酰度,具有相关系数高(r=0.990),计算值与真实值高度一致等特点。

其中A・。

zo和A・伽分别为样品在1320及1

420

cln_1处的吸光度。

从表1可以看出,各降解产物的氮含量,碳含量及DD

万方数据

值与原料壳聚糖的相应值差异较小(最大相对偏差分别为2.4%,2.3%与6.9%),且降解产物的氮含量及DD值与原料相应值的差异随着反应时间的延长而减小。

在反应的最初

15

min,降解产物的氮含量与DD值均较低,这可能是由于

原料壳聚糖的分子量很大,最初的反应体系粘度较大,而本实验采取一次加入Hz()2的投料方式,因反应的不均匀性及局部的过度氧化引起的。

2.2原料及降解产物的红外光谱

原料壳聚糖及其降解产物的红外光谱如图1所示。

其主要吸收峰的归属见表2。

从图1可以看出,原料壳聚糖与各降解产物的红外光谱在主要吸收峰的数目与位置方面均没有发生明显的变化。

各降解产物在1

735

cm“处均没有红外吸收,说明在降解过程

没有羰基类化合物生成。

对比原料与降解产物在3

388

ClTI-1

处的吸收可以看出,降解产物在此处的一()H吸收强度有所增加,且吸收峰锐化,表明随着分子量的降低,产物中一0H的量有所增加,且分子内及分子间的氢键增强,分子结构的规整度有所提高。

4000

3o(10

2Ooo

1500

1000

450

Wavenumber/cm一1

Fig,1

FFIRspectraofinitialchitosananddegradedchitosans

1:

CTS;2:

(汀§l;3:

CT§2;4:

CTS-3;

5:

CT孓4;6:

CTS-5;7:

Crs_6;8:

CT争7

Table2

PeakassignmentsofFTIR

spectraofchitosam

波数/c111—1

基团

0卜_H,N—H键伸缩振动

29

晌O

C—H键伸缩振动扣,6C_《)键伸缩振动16

8N—H(r壳聚糖,a,-chitosan)14

一CH3,一CH2变形振动

1O(卜H变形振动

C一0伸缩振动

1屿5

鹃引卯∞加%∞灌%

p构利糖苷键的特征峰

2.3原料及降解产物的核磁共振碳谱

用”CNMR分析技术进一步确定壳聚糖过氧化氢降解产物的化学结构是否发生变化。

图2为原料壳聚糖及其氧化降解产物的”CNMR谱。

化学位移占为22.3,56.0,60.2,70.2,74.9,76.6,97.6及101.3的共振峰分别归属于

第1期

光谱学与光谱分析

一CH3,C2,C5,C3,C5,C4,C1和C1碳原子L9’1…。

在参考

资料中出现两个C・碳原子的共振峰,这可能是由于C。

碳原子处于两种不同的化学环境:

端基C-碳原子所连的是羟基,而链中的C。

碳原子与糖苷键相连,其化学位移存在一定的差异。

此外,在占一174.8处还存在一个弱的共振峰,这是乙酰氨基上碳原子的共振信号,由于其弛豫时间(T1)较长,且没有氢与之相连,不能得到完全的NOE(Overhauser)效应,所以其共振峰较其他碳原子的弱。

对比图2中各样品的共振峰可以看出,壳聚糖在降解前后的碳谱几乎没有发生变化,即进一步确定了其在降解过程中化学结构的稳定性。

160

120

80

40

№2

13CNMRspectraofinitialchitosananddegradedchitosans

CTS;2:

CTS-1;3:

CTS-4;4:

CTS-7

2.4原料及降解产物的X射线衍射谱

从图3可以看出,原料壳聚糖与降解产物的X射线衍射谱存在很大的差异:

降解产物的x_射线衍射谱在20=10.3。

和20.o。

处均存在两个特征峰,这与报道的虾壳聚糖的“L-2polymorph”衍射谱一致[11’12],而原料壳聚糖只存在一个宽峰,是典型的无定形非晶化合物。

样品处理过程的温度,存放及后处理对其晶体结构有很大的影响[1引。

为了进一步了解造成原料与降解产物的固态结构存在差异的原因,将原料

溶解在1.5%HAc溶液中,振荡,待其充分溶解后,用处理降解产物的方法制备样品CTS-P’,再测定其x-射线衍射谱。

结果表明:

经同样方法处理过的原料壳聚糖(CT孓P’)与降解产物的x_射线衍射谱没有本质的区别。

该结论与已有的报道不同[14’15],这与原料壳聚糖和降解壳聚糖的处理方法不完全一致有一定的关系。

随着产物分子量的降低,降解产物的结晶度略有升高,这是由于随着产物分子量的降低,分子间的缠结减少,有利于分子的有序排列[16。

这与红外光谱分析的结果是一致的。

该实验结果与Tian等[2]报道的实验结果不同,可能的原因是在Tian等的报道中,壳聚糖的分子量差异较小(粘均分子量为1.196×107~1.378×107Da),不能很好地反映出分子量的差异对结晶度的影响。

2.5原料及降解产物的圆二色谱

以口(1—4)连接的线型多糖(如纤维素、乳糖、壳聚糖及甲壳素)的典型构象为对称双螺旋结构,螺距为1.03nln,通过链内03…05氢键维持的构象稳定性[1“。

万方数据

图4为壳聚糖及其降解产物的圆二色谱。

从图中可以看出,各样品在210tin3处均存在一个宽的负吸收峰,表明降解产物仍保持天然壳聚糖的双螺旋结构,该吸收是由于壳聚

糖分子中一NH—C(卜发色团的1/一7r‘电子跃迁引起

的[18J9|。

此外,随着反应时间的延长,降解产物在210

nnl

处的吸收峰强度逐渐趋近于原料在此处的吸收强度。

2.1节中红外分析的结果已说明,降解产物的脱乙酰度和原料壳聚糖的差异随着反应时间的延长不断缩小,这与本节的结论是一致的[20]。

lO2030

40

20/(o)

Fig.3

X-raydiffractionpatternsofinitial

chitosanand

degraded

chitosans

1:

CTS;2:

CTS-P;3:

CTS-114:

CTS-4;5:

CTS-7

10

0一lO

190

200

210

220230240250

Wavelength/nm

Fig.4

CD

spectraofinitialchitosananddegradedchitosans

3结论

通过以过氧化氢氧化法在优化的条件下降解制备了不同分子量的壳聚糖。

各降解产物的碳含量、氮含量及脱乙酰度与原料壳聚糖的相应值相比,其最大相对偏差分别为2.4%,2.3%与6.9%,且后两者随着反应时间的延长又趋近原料的,中壳聚糖的化学结构没有发生明显的变化。

X射线衍射及圆相应值。

红外光谱及核磁共振碳谱分析结果表明在降解过程二色谱分析显示各降解产物保持了原料壳聚糖的固态结构与液态时的构象。

分析结果得出,在优化的降解条件下过氧化氢氧化降解没有改变壳聚糖的天然结构。

光谱学与光谱分析第29卷

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1653.万方数据

第1期光谱学与光谱分析47SpectraAnalysesofChitosansDegradedbyHydrogenPeroxideunderOptimalConditions

LINFan91~,JIAXin-gan91,LEIWan-xuel,LIZheng-junl,ZHANGTing-youl’1.NationalEngineeringLaboratoryforCleanTechnologyofLeatherManufacture,SichuanUniversity,Chengdu610065,China

2.StateCenterofQualitySupervisionandTestforLeather,Haining314400,ChinaAbstractChitosanswithdifferentaveragemolecularweight(1500—156kDa)werepreparedunderoptimalconditionsbasedonourpreviousresearchbythedepolymeriz.ationofinitialchitosanusinghydrogenperoxide,withmaintainingthenativestructureofnaturalchitosanasprineipalconsideration.NitrogenandCarboncomponentsofinitialchitosananddegradedproductswereanalyzedbyIⅢCHlfullyautomaticnitrogendeterminationsystemandIAquidtotalorganiccarbon(T()C)analyzerrespectively.Fouriertransf01Tninfrared(FTlR),”Cnuclearmagneticresonance(”CNMR),X-raydiffractionandcirculardichroism(CD)analyseswereusedtOcharacterizethestructurepropertiesofsamples.Theresultsindicatedthatthemximumstandarddevia—tionsofcarboncontentandnitrogencontentandthedegreeofdeacetylation(DD)ofdegradedproductswiththecorrespondingvaluesoftheinitialchitosanare2.4%,2.3o/6and6.9%respectively.Besides,thedifferentiationsofthenitrogencontentandDDvalueofthedegradedproductwiththecorrespondingvaluesoftheinitialchitosanarenarrowedwiththeincreaseinthereac—tiontime.FTIRspectraofresultingproductsaresimilartOthatofinitialehitosanintermsofpeakauraherandposition,indica—ringthattherearenootherfunetionalgroupsformedduringthedegradation.13C-NMRanalysesofinitialehitosananddegradedproductsrevealedthatthechemicalstructuresofresultingchitosansarenotchangedtoanynoticeableextent.X-raydiffractionpatternsofinitialchitosananddegradedchitosansarealikeandshowcharacteristicpeaksat20=10.4。

and19.8。

underthecondi-tionthattheinitialehitosanwasdisposedasdegradedchitosans.Circulardichroismanalysesshowedthatallthesamplesexhibitabroadnegativebandlocatedatabout210nil]assignedtO九+,r‘electronictransitionofthe—NH—C()-一chromophoreonaglycosidicringinacidicmedia,whichdemonstratedthatdegradedchitosansmaintaintheirnaturalconformationinliquidstatesubstantially.Alltheseconfirmedthatthedegradedchtiosansmaintaintheirnaturalstructureandconformation,andthebreak-ageofp1,4-glucosidebondsinmaeromoleeuleisthebasicprocessunderoptimaldegradationconditions.KeywordsChitosan;Hydrogenperoxide;Degradation;Spectraanalyses;Structurecharacteristic

(ReceivedSep.28,2007;acceptedDec.28,2007)*Correspondingauthor

万方数据

优化条件下过氧化氢降解壳聚糖的光谱学研究

作者:

作者单位:

林芳,贾新刚,雷万学,李正军,张廷有,LINFang,JIAXin-gang,LEIWan-xue,LIZheng-jun,ZHANGTing-you林芳,LINFang(四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川,成都,610065;国家皮革质量监

督检验中心,浙江,海宁,314400),贾新刚,雷万学,李正军,张廷有,JIAXin-gang,LEIWan-

xue,LIZheng-jun,ZHANGTing-you(四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川,成都

610065)

光谱学与光谱

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