ConclusionBMP·9genemodifiedMSCscouldenhanceectopic
newboneformationinrabbits．TheseresultsindicatedthattheMSCstransfermediatedbyrhBMP-9genewithcationicliposomecombinewithPLGAmightbesuitableforbonetissueengineeringapplications．
KeyWordsMSCs，BMP一9，PLGA，TissueEngineering
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BMP．9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验研究
．■厶—J-
刖昌
骨缺损是指由于外伤、感染、肿瘤、骨坏死及先天畸形等多种疾病引起的骨质丧失，从而在骨组织中形成间隙。
较小范围的骨缺损可以由机体自身的再生得到修复，而大间隙的骨缺损则由于成骨细胞难以越过而不能正常愈合，若不采用适当治疗则最终仅由纤维组织充填，形成骨不连。
有研究表明，当长骨骨干缺损长度超过其直径的1．5~2．5倍时，机体便难以自愈，因而造成永久性骨不连。
骨缺损的病人在骨科患者中占有很高的比例，大约有10-15％的病人需要进行骨移植治疗。
在美国，每年涉及骨移植的病例已超过100万，而我国在这样一个人口众多的发展中国家，需要进行骨移植治疗的病例数目巨大更是不言而喻的，而且随着社会的发展，交通事故的增多，骨缺损的病人数目更是在不断的逐年攀升，现今已经发展成为严重威胁人们生活质量的主要病症之一。
骨缺损修复一直是骨科领域的难题之一，目前常用的异体骨移植、自体骨移植、人工合成替代物等均在不同程度上存在一些问题。
自体、异体骨移植等常用治疗方法存在供量不足、排异反应等并发症。
近二十年来，组织工程学的发展为骨缺损的修复开辟了新的途径。
组织工程学是应用生命科学和工程学的原理及其技术，以生物材料为载体，研究开发、设计构建或重建具有生理功能的组织和器官，然后移植到人体，成为具有修复、维持或改善受损组织功能的生物替代物的一门新兴交叉学科Il】。
现代组织工程包含三大要素：
1．种子细胞；2．支架材料；3．细胞因子。
要想获得组织再生的良好效果，三大要素缺一不可。
因此，如何获得更加理想的种子细胞，以及细胞因子的选择和使用方式一直都是研究的重心。
近年来，将细胞与特定支架材料联合培养，形成具有生命的活性组织工程化复合材料用于修复骨缺损已经取得了初步成效，但毫无疑问，如何构建更理想的组织工程化骨仍是一个值得被重视的热点。
MSCs是一类具有自我更新能力和多分化潜能的多能干细胞，能够分化为脂肪
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细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞等中胚层起源的细胞，而对于MSCs在骨组织工程中的应用，单纯的MSCs与材料的复合物诱导骨化的过程很慢，而细胞因子局部给药持续时间短、需反复给药，并且价格非常昂贵。
我们则希望能够通过一定的手段控制其向成骨细胞定向分化，将编码细胞因子的基因导入到MSCs中，复合适当材料后植入缺损步，这样能够在局部持续高效地产生细胞因子，以自分泌和旁分泌的方式诱导MSCs和组织中间充质干细胞的成骨分化，促进骨缺损的修复。
在众多细胞因子中BMPs是最有希望的，相对于其他BMPs家族成员，本实验选用的BMP．9是新近发现，研究相对较少的BMPs一种亚型。
国外有研究[21发现BMP．9是BMPs家族最具潜力的促成骨分化生长因子之一，其诱导干细胞成骨的作用甚至强于目前该领域研究的BMP．2、7。
与其他BMPs相比，BMP．9介导的骨分化作用不受BMP．3的影响，而其他成骨作用明显的BMP．2、BMP．6和BMP．7可以被抑制。
在本实验中，我们以兔骨髓MSCs作为转基因的靶细胞，将骨形态发生蛋白．9基因导入MSCs中，在体外种植于PLGA支架上，分别在体内和体外观察对比了BMP．9基因修饰对MSCs活性的影响以及诱导异位成骨的情况，为构建更优化的骨组织工程种子细胞和组织工程化骨提供了重要的实验基础。
另外，本实验选用的PLGA是PLA和PGA的共聚物，具有良好空间立体结构、可在体内良好降解的三维多孔材料，充分融合了PGA和PLA二者的优点、规避了二者的缺陷，是目前骨组织工程中使用较多的成熟的可降解生物支架材料【3】。
所用的PLGA是25％PGA：
75％PLA的共聚物是商品化的成熟产品，具有良好的孔隙率和密度，是适用于骨组织工程的支架材料。
MSCs作为一种存在于骨髓中的中胚层来源的未分化的间充质干细胞，能够通过细胞因子的调节控制其增殖分化过程，改变细胞内各种物质的合成和分泌，产生能够反应成骨特异性的标记14J：
I型胶原、ALP、OCN等，从而参与新骨形成的过程。
ALP是成骨细胞早期分化的标志，OCN主要在矿化形成期出现，是成骨细胞成熟的标志，ALP和OCN的表达程度可以反应骨的形成进程。
因此，本试验的研究主要任务是在体外通过脂质体介导BMP．9基因转染转染MSCs：
荧光显微镜观察及流式细胞学检测观察转染效率；MSCs碱性磷酸酶活性半定量测定及VonKossa’s钙结节染色观察转染前后细胞功能变化；荧光显微镜及扫描电镜观察MSCs
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在PLGA支架l-_f搀黏附、生长状况；X线摄像及组织切片染色等观察异位成骨情况。
1．材料
1．1主要仪器及材料：
自动平衡离心机上海医用分析仪器厂
台式离心机EPPENDOF（德国）
低温台式离心机EPPENDOF（日本）
凝胶成像及分析系统．．BIO．RAD（美国）紫外分光光度仪。
岛津（日本）
紫外投射仪UVITEC（英国）
电泳系统BIO．RAD（美国）
超净工作台THERMO（美国）
电子恒温摇床．．THERMO（美国）
电子分析天平METTLERTOLEDO（瑞典）
JTT．5架盘药物天平．上海医用激光仪器厂
恒温水箱上海跃进医疗器械厂
加样器。
EPPENDOF（德国）
移液器SOCOREX（瑞士）
DELTA320pH计METTLERTOLEDO（瑞典）
超低温冰箱THERMO（美国）
医用冰箱SANYO（日本）
磁力搅拌器。
上海司乐仪器有限公司
倒置荧光相差显微镜．．NIKON（日本）
电子显微摄像系统NIKON（日本）
液氮容器成都金风液氮容器公司
压力蒸汽消毒器．HTRAYAMA（日本）
电热鼓风干燥箱上海福玛实验设备有限公司C02孵箱BIO．RAD（美国）
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Milli--QBiocel超纯水系统．．Millipore（美国）制冰机SCOTSMAN（美国）
流式细胞仪．BECTONDICKINSON（美国）
酶标仪TECAN（奥地利）
扫描电镜AMRAY（美国）
切缝包，骨穿针，肝素，等常规药品及材料。
1．2菌株及质粒：
菌株：
E．coliDH5a（本实验室保存）；
质粒：
pcDNABMP-9（重庆医科大学附属儿童医院康权博士构建并惠赠）；plRES2-EGFP质粒（重庆医科大学康权博士馈赠）；
1．3主要试剂及配制：
1．3．1主要试剂：
DMEM／F．12培养基GIBCO（美国）特级胎牛血清TBD（杭州四季青公司）青霉素华北制药股份有限公司
链霉素华北制药股份有限公司
HEPESSIGMA（美国）
限制性内切酶NheI、XhoINEB（美国）GenExtractTM质粒中量抽提无内毒素试剂盒道普生物科技（北京）胰蛋白酶SIGMA（美国）
DMSO华美公司
LipofectaminerM2000INVITROGEN（美国）
ALP测定试剂盒建成生物工程研究所（南京）
PLGA材料岱罡科技有限公司（济南）
其它常规试剂等。
1．3．2试剂配制：
·细胞培养相关试剂
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（!
）DMEM—FI2培养液配制
取1000ml消毒过的大烧杯，注入约800mml的消毒过的三蒸水，首先加DMEM／F12培养基一包，溶解后，再加5．0g碳酸氢钠，加入HEPESl0．0g，加入葡萄糖3．09，加入青霉素10万u（终浓度100u／m1），链霉素6．5万u（终浓度100u／m1），定容至1000ml后调PH值（7．0~7．2），在超净台上抽滤除菌，并分装至11个100ml盐水瓶中，盖好瓶塞，用牛皮纸扎口，放在．20。
C冰箱中保存备用。
每次使用取出一瓶，无菌条件下加入已分装的灭活胎牛血清10ml后使用。
解冻后的培养液用后置于4℃保存。
②血清将冻存的100ml优等特级胎牛血清先置于室温下3h使其自然融化，然后置于
56"（2水浴30min灭活补体；消毒25ml血清瓶5个，无菌条件下分装后一20。
C冰箱
保存备用。
③胰蛋白酶称取胰蛋白酶0．259，然后再用消毒好的PBS液100ml溶解后抽滤，在无菌台
上分装在消毒后的25ml血清瓶内，放于．20℃冰箱冻存。
@PBS（pH7．0~7．4）-
取NaCI8．09，KCl0．29，无水Na2HP041．29，KH2PO,0．29，调pH值（7．叽7．4），三蒸水定容至lL，抽滤分装至10个100ml盐水瓶中，盖好瓶塞，用牛皮纸扎口，120℃，20min消毒，常温保存备用。
·DH5a细菌培养相关：
①LB液体培养基的配制取精解蛋白胨5．Og，酵母浸出粉2．59，氯化钠5．09，溶于500ml三蒸水，用
5mmolNaOH调PH值7．0；分装为100ml后120"t2，20min消毒；恒温水箱冷却至60℃，加入所需抗生素（kan，终浓度为50I_tg／1），再直接室温冷却；所有培养基4℃保存备用。
②LB固体培养基的配制及平板制作称取1．59琼脂粉（Agar），加入到上面所配置的100mlLB液体培养基中，溶
解摇匀；120。
C，20min消毒；立即置于60"C恒温水箱降温，半小时后：
加入所需
抗生素卡那霉素（Kan），轻轻摇匀；准备好tpl0cm塑料平板于消毒之超净台上；
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从水箱取出液态LB固体培养基后，尽快转移至超净台，小心倒入预备各平板中，厚度约3mm左右：
Agar凝固后立即倒扣平板，防止盖上之冷凝水污染培养基；3h后用消毒纸巾小心抹去底盖冷凝水；扣好板盖，封口胶双层密封后4。
C保存备用；
③抗生素配配制卡那霉素（Karl）：
三蒸水配制10mg／ml工作液；9220nm滤纸过滤后避光保存；
（使用前）取5ml（50mg）加入1000mlLBmedium（或LBAgar）中；最终工作液浓度：
5099／ml。
·电泳相关试剂
①TAE的配制（1L工作液）：
啊s乙酸7．569+EDTA0．3729，三蒸水定容至lL备用；
②esn的配制：
0．25％溴酚蓝（O．259）+40％蔗糖（409），三蒸水定容至100ml备用。
1．4实验动物：
2～3月龄新西兰大白兔。
2．方法‘
2．1MSCs的准备：
2．1．1MSCs的分离、培养：
新西兰大白兔全麻，侧卧位，双后肢自然伸直、交叉，暴露下面后肢内侧胫骨平台，备皮，碘酒、75％酒精常规消毒，铺洞巾（洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染），使用20ml的无菌注射器吸取O．1~o．2毫升含1000单位的肝素化生理盐水（使针道内壁肝素化，防止吸取粘稠骨髓时出现针道内的溶血），于胫骨平台穿刺吸取骨链。
穿刺针首先快速穿透皮肤进针0．5~0．8cm后，可感到明显落空感，匀速抽取骨髓血。
同法穿刺对侧，共可得骨髓血5m
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