DNA电镜技术及其应用.docx

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DNA电镜技术及其应用

DNA电镜技术及其应用

　　电子显微镜作为一种研究工具在核酸研究中已发挥专门大作用并日趋受到重视。

1859年人们第一发觉核酸为活体组织细胞核的要紧组成成份，90年后又在电镜下观看到单个核酸分子，而Avery等于1944年发觉核酸是遗传的分子基础后，更激起人们了解核酸物理结构的爱好。

1959年Aleinschmedt及Zahn成立了一种新的电镜技术，即细胞色素C展层技术（又称碱性蛋白膜技术及Kleinschmice-Zahn技术），并成功地在电镜下观看到双链DNA（dsDNA）分子，开始了应用电子显微镜研究DNA结构和功能的新时期［1］。

以后通过方式学上的不断改良，又进展了许多新的技术，普遍应用于DNA结构与功能和蛋白质-DNA彼此作用的研究。

咱们参阅了近三十连年的有关文献并结合本实验室从事核酸电镜技术研究的体会，就DNA电镜的经常使用技术及其大体应用加以介绍。

　　1　DNA电镜样品制备方式

　　　细胞色素C展层技术（碱性蛋白膜技术）［2，3］　溶液中的DNA分子呈三维无规那么超卷曲状态，电镜观看前必需将DNA分子变成二维伸展状态非聚集分子。

细胞色素C展层技术的原理确实是将DNA溶液与碱性蛋白（细胞色素C）混合，带负电的DNA分子非特异性吸附大量细胞色素C，而后者具有在水或低盐溶液表面变性形成单层膜的特性，这时缠绕其中的DNA分子也随之展开呈二维伸展状态。

将变性剂（如甲酰胺等）加入展开液中，能够避免单链DNA分子内碱基非随机配对。

细胞色素C展层技术不仅能够用于观看双链DNA分子（dsDNA），也可用于观看单链DNA分子（ssDNA），现在该方式也可称甲酰胺展层技术。

展开液（上相液）中含～μg/ml的DNA分子，～mg/ml的细胞色素C，40%～60%的甲酰胺，缓冲液的pH为。

展开液沿斜面流至下相液（蒸馏水或10%甲酰胺，10mMTris*HCL,1mMEDTA上展开，尔后用覆有支持膜的铜网取样。

单链DNA分子用此法也能较好地展开，其直径稍细，形态较为曲折。

下相液中甲酰胺浓度比上相液中低30%，缓冲液离子浓度为上相液中的10%。

　　　扩散方式［4］　扩散方式是碱性蛋白膜技术的一种转变形式，其原理是碱性蛋白在含DNA的下相液表面形成单层蛋白膜，DNA分子通过扩散运动与蛋白膜接触并吸附其上。

该方式能够大大减缓展层进程中的剪切力，尤其适用于较长的DNA分子。

其制样进程为：

配制混液，将20ng/ml的DNA，醋酸胺，加于小塑料平皿中；将一细针头蘸取细胞色素C粉末轻轻触及下相液表面，静置10～30min，使DNA扩散并吸附到蛋白膜上，用铜网取样。

对此方式进一步简化，成立了一步吸附法。

配制DNA及细胞色素C混合液，细胞色素C形成单层膜的同时，DNA分子通过扩散与对流吸附其上，静置4～5min，铜网取样。

DNA的吸附量与其浓度及大小有关，与（时刻）3/2成正比。

该方式的优势是所用DNA量较少，另外在展开单链DNA时可加入50%甲酰胺。

　　　无蛋白展层技术　细胞色素C（Mr12000）掩盖了DNA分子的精细结构及其结合的蛋白。

Vollenweider等［5］用小相对分子质量的阳离子去垢剂苯二甲基苄基氯化胺（BAC，Mr350）取代细胞色素C，成立了无蛋白展层技术（亦称BAC方式）。

制备蛋白质-DNA复合物标本，先用甲酰胺配制2mg/ml苯二甲基苄基氯化胺的贮存液，将1～2mg/ml的DNA用缓冲液或展开液稀释50倍，取20μl在蒸馏水上展开。

上述方式对技术条件转变灵敏，下相液所用水必需为新蒸馏水或超纯水并经快速预冷。

取样时最好用途理过的碳膜。

处置方式有辉光放电［6］、溴化乙锭（EB）［7］、多聚赖氨酸（Mr2000）及Alcianblue等。

　　Thomas［8］用anthrabis取代细胞色素C，也成立了一种地蛋白展层技术，以为对dsDNA、ssDNA及蛋白质-DNA复合体的制样成效优于BAC方式，该方式所用上相液中含有μg/ml的DNA、%的Anthrabis、30%的甲酰胺及缓冲液，经扩散方式取样。

另外，SDS、EB及二价阳离子等亦曾用于无蛋白制样技术。

Griffiths对蛋白质-DNA复合体的电镜研究亦有详细描述［9］。

　　　低温电镜DNA标本的制备　低温电镜（Gryoelectronmicroscopy）一直被以为是生物电子显微术中最有希望取得生物标本自然结构的手腕。

其理论基础是基于避免纯水或溶液经快速冷冻后冰晶的形成。

水结冰有三种相变形式：

常压下-70℃至-130℃形成三角形冰晶，-120℃至-140℃形成立方形冰晶，而-160℃以下形成无定形冰，即玻璃态冰。

快速冷冻后DNA样品中的水直接变成玻璃态冰，能够幸免因形成冰晶造成结构损伤。

在微筛支持膜上制备玻璃态含水的DNA样品，加一套减少电子辐射损伤的电镜技术和相衬成相方式，能够取得高分辨率的近于自然状态的DNA结构图像。

该方式也幸免了传统电镜制样时脱水、固定、吸附、染色、喷镀等处置对样品结构的破坏。

其制样方式为：

将3μl的DNA溶液（200μg/ml）置于覆有微筛支持膜的铜网上，吸去多余液体，迅速将铜网浸入液氮预冷的液体乙烷中，经低温传输装置转移到冷冻样品台或贮存于液氮中。

为取得DNA样品的高质量图像，要选择适合的微筛孔径及样品厚度，微筛的制备可用Murray成立的方式。

　　　试剂　细胞色素C和甲酰胺是DNA电镜技术中最重要的试剂。

不同型号的细胞色素C展开成效不同，有必要对不同的产品进行预实验，以选择最好的产品。

为使DNA电镜图象背景滑腻、均匀，可用溴化氰（CNBr）将细胞色素C劈开［10］：

将20mg/ml细胞色素C，用1HCl及30mg溴化氰（CNBr）混匀，室温留宿处置，经SephadexG50层析柱纯化。

上相液中甲酰胺的质量对展开成效阻碍专门大，应经纯化［11］或去离子处置［12］。

　　　支持膜［13］　细胞色素C展层技术中经常使用火棉胶膜，新制备的膜吸附性能及反差成效最好。

无蛋白展层技术利用碳膜最好，碳膜较稳固，污染小，但制备较火棉胶膜困难。

低温电镜那么需特殊的微筛支持膜。

　　　染色及喷镀　重金属染色及小角度旋转喷是增加DNA分子反差的重要手腕。

染色一样用MHCl配制的M醋酸铀溶液，利历时用90%乙醇稀释1000倍。

金属喷镀经常使用钯铱合金，以7～10℃进行旋转喷镀，可使DNA分子取得足够反差。

　　2　长度测量

　　DNA电镜技术的显著优势是能从混合分子群体中显示单个DNA分子的特点，而且利用电镜测量DNA分子大小，常比其他方式更为准确。

DNA分子大小过去经常使用分子量（dalton）或碱基（bp）表示。

1bp的DNA约为±×106daltons［14］，相当于kb。

依照电镜图像DNA的长度，即可粗略计算其相对分子质量大小。

样品在展开进程中展开力对DNA的作用及测量误差会对测量结果产生阻碍。

为排除这些因素的阻碍，制样时应加入已知相对分子质量的DNA分子作为标准，依照长度比值，也可精准地计算出DNA的长度大小。

经常使用作标准的DNA分子有SV40、pBR32二、Φx174RFⅡ、fdDNA等。

线性DNA分子一样不能用作标准。

制样时加入已知浓度及大小的DNA电镜下也可精准测定DNA浓度。

这些测定仅需5μgDNA。

　　3　DNA∶DNA异源双链画图

　　异源双链方式能够检测不同类型DNA分子间的同源序列。

将两种DNA分子进行碱变性或热变性后退火，同源序列部份杂交呈双链结构，非同源部份不能配对，在甲酰胺存在情形下维持双链状态，电镜下可显示三种结构特点：

（1）除插入或缺失外，在两种DNA分子均相同时，插入或缺失部份在双股异源双链分子中呈单链插入/缺失环；

（2）两种相同的DNA分子某一区域为其他序列取代，替代区域形成两股不能配对的单链（即替代环）；只有小段DNA相同时，那么形成一短的双股区，双侧为不能配对的单链；（3）许多单个碱基不同的两种DNA分子形成距离异源双链含一系列单链及双链区，电镜下能够确信其位置及长度，能识别50～100bp长的缺失/替代环。

异源双链方式已成功用于噬菌体［15］及病毒［16］DNA缺失、替代、插入、重复区域的定位及长度测量，说明了爪蟾的rDNA基因及距离子的排列［17］，发觉了侧枝移动现象［18］，确信了Ig可变区的编码区域［19］。

　　4　标记方式

　　细胞色素C及无蛋白展层技术很难观看到结合于DNA上的相对分子质量小于50000的蛋白，也不能识别小于100bp的DNA∶DNA或RNA∶DNA杂交体。

但如果是将电子致密物铁蛋白或胶体金标记到目的分子上再用传统方式制样即可解决此问题。

　　铁蛋白（Mr900000）具有电子致密核心，能够用化学方式直接偶联到核酸分子的3′结尾［20］。

由于铁蛋白分子较大，会损害探针的生物特异性及结合活性，因此利用生物素-（链霉）亲和素的高亲和反映性，成立了间接标记方式。

生物素（Mr244）比铁蛋白小得多，可与亲和素［Mr68000］或链霉亲和素（Mr68000）高亲和力结合。

生物素能够偶联到抗体和其他蛋白上［21］；生物素化核苷酸能够掺入核酸分子内［22］或加到RNA的3′结尾。

生物素化分子与偶联铁蛋白的亲和素或链霉亲和素结合后即可在电镜下进行观看。

利用此技术成功地进行了DNA剪切修复区的观看［23］及DNA结尾标记，并对Ad二、Φ290噬菌体DNA的结尾蛋白进行了观看。

用铁蛋白标记观看到SV40的T抗原结合位点及SV40DNA复制起始区。

抗原-抗体反映使DNA结合蛋白的信号特异性增强，单抗技术及电子致密物标记抗体的问世加速了此反映在标记技术中的应用。

另外，Wu及Davidson［24］成立了一种DNP-抗-DNP方式标记DNA结合蛋白。

第一，二硝基氟苯与DNA结合的蛋白反映，二硝基苯酚（DNP）及抗原结合到蛋白的氨基基团，再与抗DNP抗体反映，尔后结合铁蛋白或胶体金标记的抗IgG；也可结合生物素化抗IgG或生物素化SPA，再与偶联蛋白或胶体金（链霉）亲和素结合。

此法对Ad2DNA结尾蛋白的标记率可达78%。

样品能够用细胞色素C展层技术制备，而且通过双重标记能够在电镜下观看到相对分子质量小于6000的蛋白。

　　5　活性基因观看

　　1969年Miller等［25］成立了染色体展层技术，尔后应用于原核及真核系统核糖体基因体内转录的观看［26］，第一次在电镜下观看到真核活性转录基因的染色体结构。

第一从核仁中分离大部份核仁蛋白，取得核仁染色体成份rDNA染色质，用于说明前rRNA基因低级转录单位的大体结构排列。

基因区在电镜下为以DNA为轴心的DNA-蛋白细丝，被RNA聚合酶分子覆盖，约有100多个同时转录的RNA聚合酶颗粒。

聚合酶颗粒在基因5′端（转录起始部位）及3′结尾（转录终止部位）有明显的界限。

随着转录进行，新生的互补RNA转录不断延长，并形成特定的构象，在转录终止部位呈复杂的核糖核蛋白（RNP）细丝结构。

因此，Miller染色体展层技术取得了有关基因功能的重要的形态结构资料。

有关核仁分离及电镜样本制备技术及改良，Trendelenburg等进行了详细描述。

　　电镜下可观看克隆的真核基因在异种系统内的表达。

将含有昆虫rRNA基因的环形DNA注入蛙卵母细胞，展开制样后电镜下有可能识别注入的DNA上的起始转录并进行特异性分析；注入环状DNA有助于确信观看到的转录复合体是起源于注入的DNA抑或是内源性DNA。

腺粒体DNA也能装配成染色质样结构，那么它很有可能成为分析克隆的单拷贝基因转录活性、低级转录物的结构及其加工的有力工具。

　　6　RNA∶DNA杂交及R-环画图

　　RNA与DNA分子内的互补序列杂交包括两种情形:

一是RNA与完全变性的DNA杂交，另一种是在近于DNA的