分子生物学实验讲义.docx
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分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义
周天鸿李月琴朱嘉明
前言
自1989年起，我系就开设了《基因工程实验》课程，该实验课程的主要授课内容围绕着“重组质粒在大肠杆菌中的克隆与鉴定”而展开，包括：
①PCR扩增分离目的DNA片段；②载体质粒的抽提、纯化及检测；③载体及目的DNA片段的限制性核酸内切酶酶切与连接；④重组质粒转化大肠杆菌；⑤重组子的筛选、重组质粒的抽提与鉴定。
上述实验内容基本体现和反映了当时学科发展的水平，在国内高校相应的课程教学中处于领先水平，并因此在1992年获得的省级教学成果二等奖。
二十多年来，基因工程实验技术和其它各种相应技术取得了飞速发展，目前已发展产生了一套较完整的现代分子生物学实验技术体系。
随着生命科学的发展，分子生物学实验技术已应用到生物科学研究的各个领域，为了在授课内容中体现本学科的发展水平，建立先进完整的能培养高素质人才的课程体系，我们在原有实验课程基础上进行了新的摸索和建设，重新编写成本分子生物学实验教材，使本课程能够跟踪本科一流教学发展，适度先行一步，为培养高质量的人才和精品课程建设服务。
由于分子生物学实验技术体系庞大，又处于飞速发展时期，新技术和新方法不断涌现，在有限的学时内，我们只能介绍一些最为基本内容，希望学生通过本课程的学习，得到分子生物学实验的最基本的技术训练，为今后从事相应的工作打下基础。
本实验设计主要参考书为JodephSambrook，DavidW.Russill编著的《Molecularclong》第三版，F.奥斯伯等编著的《精编分子生物学实验指南》，卢圣栋等编著的《现代分子生物学实验技术》，刘进元等编著的《分子生物学实验指导》，魏群等编著的《分子生物学实验指导》，郝福英等编著的《分子生物学实验技术》等。
本实验以综合性实验为主要教学内容，将多个实验设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。
实验的主要内容是将质粒pEGFP－N1的绿色荧光蛋白基因EGFP亚克隆到质粒pUC18中进行克隆和表达，由此将分子生物学的一些最基本的实验技术包含在整个实验过程中，使同学们经过本课程的训练能掌握分子生物学实验的基本技能。
实验的主要过程如下图所示：
重组质粒的构建
实验方案
用引物18F－E（sense）和18A－2（anti－sense）扩增pEGFP－N1中的EGFP基因，扩增产物纯化后除去引物和Taq等杂物，然后用EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）双酶切，同时载体pUC18也进行相同的双酶切。
酶切液分别纯化除去小片段，再进行连接克隆，利用lacZ’的起始密码进行表达，所表达的荧光蛋白的N端有一段由7个氨基酸残基（ThrMetIleThrAsnSerMet—EGFP）组成的融合肽，分子量约28K。
PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后产生的靶片段长727bp，pUC18在多克隆位点有上述两种酶的单一位点，酶切后产生的小片段长21bp，载体大片段长2675bp。
靶片段和载体大片段连接产生的重组质粒大小为3402bp。
上游引物18F－E：
5’CGGGAATTCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3’31mer
EcoRIEGFP基因起始区域
下游引物18A－2：
5’TCGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC3’32mer
BamHIEGFP基因终止区域
本课程克隆所用的载体是pUC18，其图谱如下：
本质粒主要由Ampr基因、复制起始序列ori和lacZ－α肽基因等序列组成，lacZ－α肽基因的N端含有多克隆位点。
外源基因在多克隆位点插入后可用传统的蓝白筛选法识别重组子，靶基因可在lac启动子下表达，插入片段的阅读框与lacZ－α肽基因的阅读框一致时能进行融合表达。
目录
实验一质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA
实验二PCR扩增pEGFP-N1质粒中的EGFP基因
实验三靶DNA的纯化、靶DNA和载体DNA的酶切
实验四酶切产物的纯化及载体pUC18与EGFP基因片段的连接
实验五感受态细胞的制备和连接液的转化
实验六重组子的筛选与鉴定
实验七目标蛋白在E.coli中的表达和重组蛋白的Westernblot转膜分析
实验八植物基因组DNA提取
实验一质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA
一、实验目的
1．了解质粒抽提常用的方法和原理；掌握试剂盒制备质粒DNA的方法。
2．掌握琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA的技术和方法。
二、实验原理
细菌、放线菌和真菌细胞中染色体外外能独立复制的双链环状DNA分子叫做质粒（plasmid）。
质粒的大小约从1到200kb,在细胞中一般保持一定的拷贝数,在宿主细胞中以超螺旋状态存在，能表达所携带的遗传信息，赋于宿主一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
细菌质粒是DNA重组技术中最为常用的载体，质粒的提取方法是从事分子生物学研究的人员所必须掌握基本技术。
质粒DNA制备技术，可分为如下三个步骤：
①细菌培养与质粒扩增；②菌体收集和溶菌；③质粒DNA分离。
（一）质粒DNA提取的主要方法介绍如下：
1.碱变性抽提法（SDS法）
本法主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。
染色体DNA分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开,当pH恢复中性时，质粒DNA链迅速得到配置，重新形成完全天然的超螺旋分子，由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。
缺点：
SDS破细胞很厉害，小染色体片段和蛋白质比较多，后处理较困难。
2．溴化乙锭-氯化铯（CsCl）梯度离心法
1）不同的氯化铯浓度和不同的离心时间会成为不同的密度梯度。
2）抽提破细胞后，蛋白质，染色体DNA，质粒DNA,RNA全部释放出来，加入溴化乙锭（EB），通过EB对不同物质的插入多少而形成不同的密度梯度。
EB插入越多,密度越小。
离心后，在离心管中从上到下（密度由小到大）形成的梯度区域带如下：
蛋白质（密度最小）
染色体DNA（机械剪切力的作用断裂成线状，EB插入较多，密度较小）
质粒DNA-线状（EB插入较多，密度较小）
质粒DNA-环状（EB插入较少，密度较大）
质粒DNA-超螺旋（EB插入少，密度大）
RNA（单链，EB插入最少，密度最大）
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。
优点：
此法抽提的质粒DNA纯度高。
缺点：
1）要求高档的超速离心机。
2）成本高，氯化铯价格贵。
图1－1溴化乙锭-氯化铯（CsCl）梯度离心区域
3.TritonX-100抽提法
TritonX-100为非离子极性剂，在溶液中不形成离子，破细胞比较温和。
使用该试剂是为了破细胞时不要太激烈，只形成孔状破裂，使质粒DNA释出（当然还有RNA和一些小片段的染色体DNA和蛋白质），而不释出大片段的染色体DNA。
当离心时染色体DNA的大片段与细胞膜的网状碎片附在一起，与蛋白质一起被离心沉淀，而质粒DNA则留在上清。
所以细胞膜破裂的程度是实验的关键。
优点：
抽提的质粒比较纯，较好用,TritonX-100不影响后续实验，可以大量抽提。
缺点：
比试剂盒抽提时间要长。
4．试剂盒抽提法（本实验采用）
人们使用碱与SDS裂解法从.E.coli中分离制备质粒DNA已经有20多年的历史。
将细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂（如NaOH和SDS）中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为他们在拓扑学上是相互缠绕的（超螺环结构）。
只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去沉淀，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
早在20世纪50年代，人们就已经知道，在较低pH值和高盐浓度环境下，DNA能与硅胶（Silicagel）可逆结合。
DNA双链与硅化材料相互作用的原理普遍认为是DNA分子中磷酸二酯键在较低pH值和高盐浓度环境下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。
双链的DNA分子一旦被硅胶吸附，则以天然状态或部分变性状态存在，不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大分子的溶剂（如70％乙醇）将其洗脱下来。
但是，经过水溶性缓冲液（通常为TE或水）重新水化后，DNA就能从层析柱上定量回收。
优点：
快且纯。
（二）琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA的方法简介
在高于等电点的pH溶液中，DNA分子带负电荷（由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷），在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子在凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型，与相对分子质量的对数值成反比关系。
质粒有三种构型：
①超螺旋的共价闭台环状质粒DNA（covalentclosedcircularDNA，简称cccDNA）；②开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条单链断裂（opencircularDNA，简称ocDNA）；③线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的两条单链均发生断裂（linerDNA，简称lDNA）。
这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。
此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下，也能直接检测到。
需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构形和方位进行电泳。
选择什么条件进行电泳主要取决于被分离的DNA片段的大小。
聚丙烯酰胺凝胶最适合分离小片段DNA（5～500bp）。
它的分辨率非常强，长度上相差lbp或质量上相差0.1％的DNA都可以彼此分离。
虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比在制备和操作上还是更繁琐些。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。
琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率略低，但它的分离范围更大。
50bp到百万bp长的DNA都可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶中分离。
小片段DNA（50～20000bp）最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。
在这些条件下，DNA泳动速率通常随DNA片段长度的增加而减少，但与电场强度成正比。
然而这一简明的相关性当DNA片段长度超过一个最大极限值时立即被破坏，这种情况主要是由于凝胶的构成和电场强度决定的。
当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就达到它分辨率的极限。
此时，DNA不再被凝胶按其大小筛分，而必须以一端在前的方式在介质中迁移，就像通过曲折而又空间有限的管子。
这种迁移模式称作“蠕行”（reptation）。
凝胶的孔径越大，能被分离的DNA就越大，因此用低浓度琼脂糖（0.1％～0.2％，m／V）灌制的凝胶可以分辨很大的DNA分子。
但是这样的凝胶很脆，容易碎裂，并且需要用几天的时间电泳。
即使如此，它也不能分辨大于750kb的线状DNA分子。
各种类型琼脂糖分辨DNA大小的范围
琼脂糖／％标准高强度低熔点低黏性低熔点
0.3
0.5700bp－25kb
0.8500bp－15kb800bp－10kb800bp－Okb
1.0250bp－12kb400bp－8kb400bp－8kb
1.2150bp－6kb300bp－7kb300bp－7kb
1.580bp－4kb200bp－4kb200bp－4kb
2.0100bp-3kb100bp－3kb
3.0500bp－1kb500bp－1kb
4.0100bp－500bp
6.O10bp－100bp
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1—3）和β（1—4）糖苷键交替构成的线状聚合物。
L-半乳糖残基在3和6位之间形成脱水连接。
琼脂糖链形成螺旋纤维，后者再聚合成半径20～30nm的超螺旋结构。
琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。
商品化的琼脂糖聚合物每个链约含800个半乳糖残基。
然而，琼脂糖并不是均一的，不同的制造商或不同的生产批次的多糖链的平均长度都是不同的。
此外，较低等级的琼脂糖也许存在其他多糖、盐和蛋白质的污染。
这种变异性（非均一性）影响琼脂糖凝结和熔化的温度、DNA的筛分和从凝胶中回收的DNA作为酶切底物的能力。
应用特制等级的琼脂糖可以减少以上潜在的问题，因为它们经检查不含抑制剂和核酸酶，并且在溴化乙锭染色后产生很少的背景荧光。
三、实验仪器、材料与试剂
1．器材
高速离心机、微量移液器、1.5mLEP管（因早期较广泛使用的产品的商标为Eppendorf，现常称这种离心管为Eppendorf管，即EP管）、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外检测仪。
2．试剂
1）E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKit（OMEGA）：
①HiBindDNA结合柱
②2mLMicrofugeTube
③SolutionⅠ／RNaseA混和液（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl维持pH值、EDTA抑制核酸酶、RNaseA1降解RNA）
④SolutionⅡ（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性）
⑤SolutionⅢ（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH值）
⑥HBBuffer（乙酸钠洗脱蛋白质、糖类等大分子杂质）
⑦DNAWashBuffer（70％乙醇洗脱盐离子）
⑧ElutionBuffer（TEpH8.5洗脱质粒DNA）
2）含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α
3）LB完全培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaClpH7.5）：
试管斜面一支，5毫升培养液一支、250毫升培养液一瓶（以36位学生计）。
4）100mg/mL氨苄青霉素溶液
5）电泳缓冲液TAE：
0.04mol/LTris—乙酸（pH8.0）
0.001mol/LEDTA
6）6×加样缓冲液：
0.25%溴酚兰
40%w/v蔗糖
7）溴化乙锭溶液：
5mg/mL溴化乙锭（EB）
使用时，凝胶中终浓度为0．5μg／mL。
8）琼脂糖
9）DNA分子量标记
四、实验步骤
（一）质粒DNA的提取（每人独自提取）
1.用接种棒取一环保存的含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α在LB完全培养基斜面上（含Amp100μg/mL）接种，37℃培养过夜，活化菌株。
2.在5毫升LB培养液中，用微量进样器加入5微升100mg/mL氨苄青霉素溶液。
同时接入已活化的含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α一环，37℃援床培养过夜。
3.取250微升100mg/mL氨苄青霉素溶液于250毫升LB培养液中，然后取2.5毫升过夜培养物转接进去（1%接种量），37℃摇床培养过夜。
4.第二天用1.5mLEP管收集细胞：
取菌液1.5mL于离心管中10,000rpm离心1min，弃尽上清，重复收集二次（共4.5mL菌液），将管口倒置在纸巾上，轻轻敲击，使上清流出，管壁上不应有残留上清。
5.用手指弹击管底，使菌体松散（加液前一定要使菌体散开，否则加液后很难混匀，影响菌体裂解，降低产量。
），然后加入250μlSolutionⅠ／RNaseA混和液，混匀。
6．往重悬混和液中加入250μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀4—6次。
此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min。
7．加入350μlSolutionⅢ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。
8．室温下，≥10000×g离心l0min。
若离心后上清液仍有未离心干净的白色絮状物，可重复离心除去絮状物以提高产品纯度。
9．转移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中，室温下，10000×g离心lmin，倒去收集管中的滤液。
10.把柱子重新装回收集管，加入500μlHBBuffer，按上述条件离心，弃去滤液。
11．把柱子重新装回收集管，加入700μlDNAWashBuffer，按上述条件离心，弃去滤液。
注意：
浓缩的DNAWashBuffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。
12.（可选）弃去滤液，重复第11步骤一次。
13．弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质。
注意：
不要忽略此步----这对去除柱子中残留的乙醇至关重要。
14．把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入50μlElutionBuffer（TEbuffer或ddH2O）到柱子基质中，静止1－2分钟，10000×g离心lmin洗脱出DNA。
（二）质粒DNA的琼脂糖凝胶检测
1．胶板的准备：
取有机玻璃内槽、样品梳子洗净，晾干，用大透明胶布将机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。
2．将有机玻璃内槽置于水平位置，并放好梳子。
3．0.8%琼脂糖凝胶液配置：
称取0.32g琼脂糖,放入三角瓶中，加入40mLTAE电泳缓冲液，置微波炉中加热至完全溶化，取出摇匀，加5μL5mg/mL溴化乙锭。
注意：
溴化乙锭属吖啶类染料，是移码诱变剂，有致癌嫌疑，操作时请带手套，勿直接接触皮肤，所有含EB的废弃物均应小心处理置于规定的场所。
4．倒胶：
将冷却至60℃左右（不烫手即可）的凝胶液慢慢倒入有机玻璃内槽（注意不要有气泡，若有则用吸管吸走）。
等胶凝固后，小心取出梳子，取下两侧透明胶布，放入电泳槽内，加电泳缓冲液至电泳槽中，使液面高于胶面1mm左右。
5．加样:
取前面提取到的质粒DNA样品5μL，加1μL6×加样缓冲液在蜡膜上混匀，用移液枪将混合液小心加入凝胶上的加液孔。
同时取6μL分子量标记点样，作为对照。
6．电泳:
接通电泳仪电源（点样孔端要在负极），DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V／cm，直至溴酚蓝染料带拉开一定距离时，停止电泳。
7．观察:
将凝胶放在凝胶成像仪，观察所抽提到的质粒DNA的纯度和浓度，拍摄照片保存。
电泳结果如图1－1所示。
8．取2μl样品用MillQ水稀释至50μl后测定DNA的浓度（约0.15μg/μL）及纯度。
图1－1pUC18琼脂糖凝胶电泳结果示意图
实验二PCR扩增pEGFP-N1质粒中的EGFP基因
一、实验目的
了解聚合酶链反应DNA扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。
二、实验原理
PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应是1986年由KallisMullis发明的。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。
PCR技术已成为方法学上的一次革命，它的出现极大地推动了分子生物学的研究和发展。
PCR以两种与靶DNA两侧的两条链杂交的寡核苷酸为引物，经酶促合成特异DNA片段，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增，主要过程如图2－1。
置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，在72℃条件下由DNA聚合酶进行聚合反应，将单核苷酸加到引物3'，按碱基配对原则5'→3'方向延伸，合成DNA新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏3'→5'核酸外切酶活性，不能纠正反应中掺入的错误核苷酸，估计每聚合9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过InnisM·A发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
图2－1PCR原理示意图
PCR技术应用广泛，不可能用一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。
不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。
1、模板：
单、双链DNA和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。
虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng量级的克隆DNA，μg级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，TaqDNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。
2、引物：
引物是决定PCR结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。
（1）尽可能选择碱基随机分布，GC含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。
（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'末端）的序列。
（3）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。
（4）引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。
（5）引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。
3、缓冲液：
PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCl2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP的浓度为0.2mM时），浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量降低。
四种dNTP浓度通常每种都是0.05mM—0.2mM。
过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。
四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。
另外dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变。
Taq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是1—4单位/100ul，浓度过高，产生过多的非特异片段。
4、循环参数：
PCR循环是把起始材料加热到90—95℃，保持短时间使双链DNA解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退火；再升温至70—75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。
解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
用DNA扩增仪时，94℃保持1分钟可使模板的起始物完全变性。
若用低于94℃的条件，则应适当延长时间。
引物与模板退火温度由引物的长度及G+C含量决定。
适时退火
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